Tabiatga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi CSS uchun cheklangan qo'llab-quvvatlanadi. Eng yaxshi tajriba uchun brauzerning yangiroq versiyasidan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da muvofiqlik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytlarni uslubsiz va JavaScript-ni ko'rsatamiz.
Genom ketma-ketligi yuqumli kasalliklarni tadqiq qilish sohasini jonlantirdi, kasallikning epidemiologiyasi, patogenezi, xost-patogen o'zaro ta'siri va patogenlarga yuklangan evolyutsiya jarayonini ochib berdi. Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC) Mycobacterium bovisni quruqlikdagi sutemizuvchilarda sil kasalligini (TB) qo'zg'atuvchi hayvonlarga moslashuvchi a'zolaridan biri sifatida qaraydi va bakteriya evolyutsiyasining odatiy modelidir. Boshqa MTBC a'zolari singari, Mycobacterium bovis ham qat'iy klonlangan, asta-sekin rivojlanayotgan patogen hisoblanadi va rekombinatsiya yoki gorizontal gen o'tkazish belgisi yo'qligi aniq. Ushbu ishda biz qoramollarning genetik xilma-xilligi haqida tushunchaga ega bo'lish uchun M. Evolyutsion kuchga ega bo'lish uchun turli zotlardan (Yevropa va Afrika) 70 ta qoramol M.dan tashkil topgan butun genom ketma-ketligi (WGS) ma'lumotlar to'plamiga qiyosiy genomikani qo'llaymiz. Qayta tashkil etish belgilarini baholash uchun uch xil usul qo'llaniladi. Global miqyosda kam sonli rekombinatsiya hodisalari aniqlangan va mustahkam qo'llab-quvvatlangan ikkita mustaqil usul bilan tasdiqlangan. Shunga qaramay, mutatsiyalar bilan solishtirganda, rekombinatsiya M. bovisning xilma-xilligiga zaifroq ta'sir qiladi (umumiy r / m = 0,037). Bizning ma'lumotlar to'plamimizdagi Mycobacterium bovis klonal kompleksida olingan o'rtacha r / m farqi umumiy tushunchaga mos keladi rekombinatsiya darajasi bir xil taksonomik turlarga tayinlangan nasllar orasida katta farq qilishi mumkin. Ushbu ishlarga asoslanib, Mycobacterium bovisdagi rekombinatsiyani inkor etib bo'lmaydi, shuning uchun u kelajakdagi qiyosiy genomik tadqiqotlarda keyingi sa'y-harakatlarning mavzusi bo'lishi kerak, bunda butun dunyo bo'ylab turli epidemiologik stsenariylardan katta ma'lumotlar to'plamining WGS muhim ahamiyatga ega. Keyinchalik, ko'p mezbonli sil kasalligining tarqalishidan kichikroq Mycobacterium bovis ma'lumotlar to'plamida (n = 42) qo'shimcha tahlil o'tkazildi va 1800 dan ortiq lokuslar aniqlandi, ulardan kamida bittasi bitta nukleotid polimorfizmini (SNP) ko'rsatdi. Koʻpchilik (87,1%) kodlash hududida joylashgan boʻlib, sinonimik oʻzgarishlarning sinonimik boʻlmagan oʻzgarishlari (dN/dS) global nisbati 1,5 dan oshadi, bu esa ijobiy tanlanish M. bovisga taʼsir etuvchi muhim evolyutsion kuch ekanligini koʻrsatadi. SNPlarning yuqori qismi "lipid almashinuvi", "hujayra devori va hujayra jarayonlari", "oraliq metabolizm va nafas olish" funktsional toifalariga boy genlarda aniqlandi, bu ularning Mycobacterium bovis biologiyasi va evolyutsiyasidagi potentsialini ochib berdi. MTBC ajdodlari genlarini gorizontal ravishda o'tkazishga moyil bo'lgan va 3R (DNK ta'mirlash, replikatsiya va rekombinatsiya) tizimiga kiritilgan genlarni diqqat bilan ko'rib chiqish Taijima D neytral testining global o'rtacha salbiy qiymatini ko'rsatadi, bu o'tgan selektiv skanerdan dalolat beradi. uy egasi bilan jang qiling.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC) bakterial patogenlarning eng muvaffaqiyatli taksonlaridan biri va bakterial evolyutsiyaning odatiy holidir. Uning a'zolari genomik darajada hayratlanarli darajada yuqori nukleotid o'ziga xosligini ko'rsatadi (> 99%)1,2. Turli MTBC ekotiplari mikro-sut emizuvchilardan tortib to odamgacha bo'lgan keng doiradagi mezbon turlarida yuqumli granulomatoz kasallik bo'lgan sil kasalligini (TB) keltirib chiqarishi mumkin3,4,5. Hozirgi vaqtda kompleksga odamlar kiradi [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] va hayvonlarga moslashgan patogenlar (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium, Mycobacterium, mycobacterium, surBaacterium" shimpanze" va "dassie") 5,6. M. canettii (shuningdek, "Nodobacter glabrata" nomi bilan ham tanilgan) Yuqorida aytib o'tilgan mikobakteriyalar bilan o'rtacha nukleotid identifikatsiyasi 98% ni tashkil qiladi va qiyosiy genomika ishlari M. canettii va MTBC ning qolgan qismi yaqinda umumiy ajdoddan ajralib chiqqanligini ko'rsatdi.7 Ushbu kontseptsiyani M.MT a'zosi deb ataydi.
MTBC tizimli ravishda qat'iy klonal kompleks sifatida tavsiflanadi va uning populyatsiyasi tuzilishi kamaygan xilma-xillik, to'siqlar, selektiv skanerlash va genetik drift bilan aniq boshqariladi9,10. Agar yo'qolgan polimorfizmlar kabi murakkab qat'iy klonal evolyutsiyani rekombinatsiya bilan tiklash mumkin emas. Ushbu asosga asoslanib, MTBC evolyutsiyasining molekulyar markerlari sifatida differentsial mintaqa (RD) va TbD1 (Mtb o'ziga xos o'chirish 1 mintaqasi) ning ketma-ket genomik o'chirilishi taklif qilingan. Qiyosiy genomika va butun genom ketma-ketligi (WGS) ishi inson tomonidan moslashtirilgan a'zolarning to'qqiz avlodga bo'linishini qo'llab-quvvatlaydi (Mycobacterium tuberculosis L1 dan L4, L7 va L8; va Mycobacterium africanum L5, L6 va L9), L2 dan L4 gacha bo'lgan nasllarni o'chirish T111b. Bundan tashqari, hayvonlarga moslashgan a'zolar umumiy ajdodga ega bo'lishlari taklif etiladi, bu RD7, RD8, RD9 va RD102, 5 va 14-da sinfga xos o'chirishlar bilan belgilanadi.
Gorizontal gen transferi (HGT) va rekombinatsiya hodisalari kamdan-kam uchraydi va butun MTBC a'zosining turli tarixida emas, balki MTBC ajdodlarida sodir bo'ladi15,16,17. Xyuz va hamkorlar (2002) va Gutacker va hamkorlar (2006) tomonidan tayyorlangan ikkita dastlabki hisobotlarda rekombinatsiya hodisalari M. tuberculosis shtammlarida o'ziga xos lokuslarni belgilovchi polimorfizmlarni shakllantirishga yordam berishi mumkinligini ko'rsatdi18,19. MTBCda rekombinatsiyaning aniq etishmasligining sabablari: (1) mexanik jarayon va HGT qobiliyatini yo'qotish; (2) HGT hodisalarining kamligi; (3) MTBC nicheda rekombinatsiya hodisalari ehtimoli yo'q14,17. So'nggi paytlarda MTBC shtammi 20 va Mycobacterium bovis 21 uchun qo'llaniladigan ba'zi butun genom sekvensiyasi (WGS) tadqiqotlari rekombinatsiyaning dalillarini taqdim etdi, bu birinchi bo'lib MTBC shtammlari ko'pincha kichik DNK parchalarini almashishini ko'rsatdi, ammo cheklangan nukleotidlar ketma-ketligi o'zgarishi sababli, bu hodisalar hali ham sezilmaydi.
Mycobacterium bovis chorva mollaridan (asosan qoramollardan) eng koʻp tiklangan MTBC aʼzosi boʻlsa-da, uni erkin yuradigan va oʻralgan yovvoyi hayvonlardan ham ajratib olish mumkin4,22,23,24. M. bovis beshta asosiy klonal komplekslarga aylandi [Yevropa 1 (Eu1), Yevropa 2 (Eu2), Yevropa 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1) va Afrika 2 (Af2)], spoligotiplash profiliga ko'ra, o'ziga xos o'chirishlar Va yagona nukleotid polimorfizmlari (SNPs) 252, 282, o'ziga xos. Ushbu klonal komplekslar Mycobacterium bovis populyatsiyasining xilma-xil tuzilishini va uning geografik mintaqalar bilan bog'lanishini namoyish etadi. Bundan tashqari, Zimpel va uning hamkorlari (2020) tomonidan olib borilgan so'nggi WGS ishlari 1900 dan ortiq genomga ega Mycobacterium bovis SNP ga asoslangan filogeniyani ishlab chiqdi, bu kamida to'rt xil nasl borligini ko'rsatadi (Lb1 dan Lb1 dan Lb4 gacha), ular geografik jihatdan to'liq aniqlanmagan bo'lsa-da, oldingi murakkablik bilan aniqlanishi mumkin emas. tasdiqlangan 30. Ushbu mualliflar filogeniya va molekulyar tanishishning differentsial tahlilini o'tkazdilar, ammo rekombinatsiyani o'rganmaganlar30.
Spoligotiplash, MIRU-VNTR (mikobakteriyalar bilan kesishgan takroriy birlik o'zgaruvchan tandem takrorlash soni) va yaqinda SNP terish kabi turli molekulyar usullardan foydalangan holda oldingi ishlar M. bovis shtammlari 31,32,33, 34,35 orasida genetik xilma-xillikning ma'lum darajasini aniqladi. Genetik o'zgaruvchanlikni farqlash kasallik epidemiologiyasini o'rganishda muhim vositaga aylandi, bu patogenez, virulentlik va kasallikning tarqalishini chuqur tushunish uchun yordam beradi. WGS usulining paydo bo'lishi turli xostlar va epidemiologik stsenariylarga moslashish va chidamlilik jarayonida Mycobacterium bovis genomi tomonidan qo'yilgan evolyutsion harakatlantiruvchi omillarni aniqlash imkonini beradi.
Ushbu ishda biz Mycoplasma bovis ning evolyutsion jarayoni haqida tushunchaga ega bo'lish, ayniqsa filogenetik munosabatlar va rekombinatsiya hodisalarini hal qilish uchun turli xil Mycoplasma bovis ma'lumotlar to'plami (n = 70), shu jumladan turli klonal komplekslardan olingan izolatlar bo'yicha qiyosiy genomik tahlildan foydalanamiz. Ushbu tahlilga qo'shimcha sifatida, Portugaliya 31,36 ning yaxshi tavsiflangan ko'p mezbonli sil kasalligi hududidan olingan M. bovis izolatlarining (n = 42) kichik ma'lumotlar to'plami o'ziga xos bo'lmaganligi haqida xulosa chiqarish uchun qo'shimcha o'rganildi. adabiyot, ular HGT orqali MTBC ajdodlari tomonidan olingan 37,38 bo'lib, 3R (DNK ta'mirlash, replikatsiya va rekombinatsiya) tizimi gen komponentlarini kodlaydi 39. HGT orqali olingan genlarni tanlang, chunki ular qadimgi polimorfizmlarni ifodalashi mumkin, shuning uchun ular sinonimik o'zgarishlarning yuqori qismini o'z ichiga olishi kutilmoqda. 3R tizimiga kiritilgan genlar tanlangan, chunki M. tuberculosis shtammlari bo'yicha oldingi ishlar ushbu genlar ustida ishlaydigan umumiy salbiy / tozalash tanlovlarini ko'rsatdi va ular evolyutsiyada muhim rol o'ynashi mumkin 39. Ushbu ishning yana bir maqsadi qayta tashkil etish hodisalari mavjudligi haqida xulosa chiqarishdir. Shu sababli, bizning Portugaliyadagi ma'lumotlar to'plamimiz faqat Evropa klon kompleksi 2 genomlarini va klon kompleksi tayinlanmagan shtammlarni o'z ichiga olganligini hisobga olib, biz barcha klon komplekslarining vakilini olish va natijalarning mustahkamligi va kengligini yaxshilash uchun hammaga ochiq genom ma'lumotlarini kiritishga qaror qildik.
Portugaliya endemik koʻp xostli sil kasalligidan 42 ta yangi ketma-ket Mikoplazma bovis genomlari (quyida batafsil maʼlumot), ilgari epidemiologik nuqtai nazardan tavsiflangan36, ushbu ishning markazidir. Portugaliyadan olingan maʼlumotlar toʻplamida faqat Yevropa 2 klon komplekslari va maxsus komplekslari boʻlmagan shtammlar vakillari borligini hisobga olib, M. bovis klon komplekslarining barcha vakillarini oʻz ichiga olgan maʼlumotlar toʻplamini kengaytirish uchun hammaga ochiq butun genom sekvensiyasi maʼlumotlari qoʻshildi. Shu sababli, ushbu ishda uchta butun genom ketma-ketligi ma'lumotlar manbalaridan foydalanilgan: to'liq/qoralama genom yig'ilishi, NCBI (Milliy biotexnologiya ma'lumot markazi) da saqlanadigan 10 tagacha iskala (n = 15 izolat); SRAda saqlanadi (Sequence o'qish arxivining Illumina fastq fayli) M. bovis klonlarining murakkab xilma-xilligini ifodalaydi (n = 12 izolat)30; va Portugaliyadan 42 ta yangi ketma-ket genomlar. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI qidiruvidan chiqarildi. M. bovis AF2122/97 odatda ma'lumotlar to'plamiga kiritiladigan mos yozuvlar genomi sifatida ishlatiladi. Afrika 1 klonlash kompleksi bilan ifodalangan butun genom ketma-ketligi jamoatchilikka mavjud emasligi va Af2 va Eu1 reprezentativ shtammlaridagi genomlarning kam sonliligi sababli, bu holatlarda SRA tomonidan taqdim etilgan asl sekvensiya ma'lumotlaridan foydalanilgan. Zimpel va uning hamkorlarining ishi (2020) yuqorida tilga olingan klonlash kompleksidan genomni aniqlashga yordam berdi va ma'lumotlar to'plamiga kiritish uchun Mycobacterium bovisni tanlashga yordam berdi. Eu3 uchun genomning faqat bitta turi tasvirlangan (Branger va boshq., 2020), shuning uchun biz kiritgan genom Eu3 kompleksining alohida vakili hisoblanadi.
Global miqyosda ushbu ma'lumotlar to'plami 1985 yildan 2016 yilgacha 12 mamlakatda tarqalgan 8 ta uy egasi turidan ajratilgan 70 ta qoramol M. bovisni o'z ichiga oladi. 36 turi Eu2, 7 turi Eu1, 1 turi Eu3, 3 turi Af1, 4 turi Af2 va 19 tasi hech qanday attribudaga tegishli emas. Ushbu tadqiqotda foydalanilgan Mycobacterium bovis haqida batafsil ma'lumot (shu jumladan qo'shilish raqami) 1-jadvalda va qo'shimcha 1-jadvalda keltirilgan.
Portugaliyadagi hayvonlar tuberkulyozi oʻchogʻidan Mycobacterium bovis ning 42 yangi ketma-ket butun genomlari va 12 yildan ortiq vaqt davomida tarqatilgan ushbu tadqiqot markazi hisoblanadi, chunki potentsial yovvoyi tabiat va chorvachilik kasalliklari tizimi muntazam ravishda 31,36 (qoʻshimcha 1-rasm) kuzatilgan. Keyingi protseduralarga ko'ra, bu shtammlar 2003 yildan 2015 yilgacha qoramol (n = 14), qizil kiyik (n = 16) va yovvoyi cho'chqa (n = 12) dan ajratilgan: tavsiya etilgan protokol ko'rsatmalariga muvofiq hayvonlarni to'plang va boshqaring To'qimalar namunalari OIE Er usti hayvonlari qo'llanmasida mavjud va Stonebrens-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jan-2015. piruvat qattiq muhit va suyuq muhit. Madaniyatlar 37 ° C da inkubatsiya qilinadi va kamida 12 hafta davomida haftada bir marta o'sishi tekshiriladi. Koloniyalar to'g'ridan-to'g'ri -80ºC da glitserin eritmasida saqlanadi. Mycobacterium selektiv muhitida (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) asl arxivlangan namunalar WGS dasturining DNKsini olish uchun in vitroda bitta in vitro o'tish orqali o'tkazildi. Buning uchun muzlatilgan kultura eritmasi 5% natriy piruvat va 10% ADS (50 g albumin, 20 g glyukoza, 1 L suvda 8,5 g natriy xlorid) bilan Middlebrook 7H9 da 37 ° C Retrain da boyitilgan. 4 haftalik o'sishdan so'ng, vosita yangilandi va o'sish kuzatilmaguncha madaniyat muntazam ravishda kuzatildi. Hujayralar santrifüj orqali yig'ib olindi, pellet 500 mL fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS) qayta suspenziya qilindi, 30 daqiqa davomida 99 ° C da isitiladi, santrifüj qilinadi va supernatant WGS ga qadar -20 ° C da saqlanadi. Barcha protseduralar 3-darajali bioxavfsizlik inshootlarida amalga oshiriladi.
WGS juftlashtirilgan genom kutubxonasi har bir DNK namunasining noyob indeksi yordamida tayyorlanadi va ketma-ketlikni aniqlash uchun Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 ta namuna) va HiSeq (2 × 150 pb) (ikki izolat) texnologiyasidan (Eurofins Genomics, Germaniya) foydalanadi. Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga ko'ra, genomik DNKni ketma-ketlashtirish uchun ikki tomonlama modul biriktirilgan Illumina Genom Analizatoridan foydalaning va kutubxonani qurish uchun Illumina-dan Nextera XT DNK Library Prep Kit-dan foydalaning.
SRA (n = 12) dan tiklangan ma'lumotlarni hisobga olgan holda, klon kompleksining identifikatsiyasidan tegishli nashrning 30, 41, 43 metama'lumotlari sifatida foydalanish mumkin. To'liq genomni ko'rib chiqishda, Mycobacterium bovis AF2122/97 va Mycobacterium bovis bundan mustasno, E 3601u va E. 25, 29, mos ravishda, u Mycobacterium tuberculosis H37Rv ning to'liq genomi bilan bir xil (NCBI kirish raqami NC_000962.3). Genomni moslashtirish MAFFT (aminokislotalar yoki nukleotidlar ketma-ketligini bir nechta tekislash dasturi, versiya 7.458) va -addfragments48 parametri yordamida amalga oshiriladi. Keyin, turli xil klonal komplekslarning yo'qligi va / yoki SNP xususiyatlarining mavjudligini qidiring.
Yangi ketma-ketlashtirilgan Mycobacterium bovis (n = 42) va yig'ilgan genom loyihasining asl nusxalari (n = 3) kompleksni vSNP quvur liniyasi orqali Mycobacterium tuberculosis H37Rv mos yozuvlar genomiga moslashtiradi va turli klonlarning o'chirilishi va/yoki SNP xususiyatlarining mavjudligi Qidiruv o'tkazildi.
Tegishli klonal kompleksga genomik ma'lumotlarni tayinlash uchun xususiyatlarning etishmasligi va / yoki SNP va spoligotiplash profillarining mavjudligi / yo'qligi haqida ma'lumot to'plang. To'rtta loyiha assambleyasi uchun spoligotiplash profilini xulosa qilib bo'lmaydi, shuning uchun ular "murakkablik yo'q" guruhiga kiritilgan.
Ushbu ishdan so'ng bioinformatika bo'yicha ish jarayoni de novo yig'ish va xaritalashdan boshlab, rekombinatsiya hodisalari va o'ziga xos genom polimorfizmlarini o'rganishdan iborat bo'lgan mos yozuvlar strategiyasiga qadar boshlanadi. 1-rasmda bajarilgan bosqichlarning sxemasi keltirilgan. Rekombinatsiyani tahlil qilish uchun barcha genomlar xulosalar va tegishli ko'rsatkichlarning mustahkamligini oshirish uchun ishlatiladi.
Genom konsensus ketma-ketligini yaratishdagi xatolarni kamaytirish uchun biz birinchi navbatda de novo yig'ilishini oldik, keyin esa bir nechta asosiy hizalanishlarni oldik. Unicycler quvur liniyasi hozirda https://github.com/rrwick/Unicycler49 manzilida mavjud va 54 ta ketma-ket genomlarni de novo yig'ish uchun ishlatiladi (SRA'dan tiklangan 42 yangi ketma-ketlik va 12 fastq fayl). Muxtasar qilib aytganda, noldan yig'ilishdan oldin FastQC 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) va Trimmomatic 0.36 versiyalarida o'qish sifati tahlili amalga oshirildi ("O'qishdan adapterlarni va boshqa yoritishga xos ketma-ketliklarni kesish" va "O'qish sifati 2 dan pastroq bo'lsa, asoslarni kesish" varianti) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Keyin genom yig'ish uchun SPAdes optimiser49, yig'ishdan keyingi optimallashtirish uchun Pilon 1.1851 versiyasi ishlatilgan. Noto'g'ri yig'ilishning oldini olish uchun konservativ ko'prik rejimi tanlandi va k-mer o'lchami qidirildi va o'qish uzunligining 20% dan 95% gacha tanlandi. SPAdes ko'rsatmalariga rioya qiling va o'qish hajmini ko'rib chiqing, 300 bp dan kichik kontiglarni o'chiring va 52 dan 20 o'qish chuqurligi chegarasini o'rnating. De novo yig'ish strategiyasida juda takrorlanadigan prolin-glutamat (PE) va prolin-prolin glutamat (PPE) paraloglari kabi genomik hududlar olib tashlanmadi.
De novo yig'ilishining sifati QUAST quvur liniyasi (http://quast.sourceforge.net/quast.html) orqali baholanadi, bu kontig va M. bovis AF2122/97 mos yozuvlar genomini (NCBI kirish raqami LT708304.1) xaritalash (qo'shimcha sifat parametrlari uchun 1-ga qarang) yangilanishini osonlashtiradi.
vSNP quvur liniyasi (https://github.com/USDA-VS/vSNP) yordamida Illumina sekvensiyasidan yangi sekvensiyalangan M. bovisning FASTQ fayli M. bovis AF2122/97 mos yozuvlar genomi (LT708304.1) bilan taqqoslanadi. Genom tahlili asboblar to'plami (GATK) 53, 54, 55 ning eng yaxshi amaliyot tavsiyalariga ko'ra, qayta kalibrlash uchun standart filtr parametrlarini yoki variant massa ballarini qo'llang. Natijalar 150 va AC = 2 boʻlgan eng past SAMtools ommaviy ball yordamida filtrlanadi. Kontaminatsiyani istisno qilish uchun koʻrsatkichlarni tekshirish uchun Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) dan ham foydalaning. Bizning ishimizda ketma-ketlik strategiyalarini xaritalash uchun ishlatiladigan vSNP quvur liniyasi bir qator aniqlangan SNP va maqsadlarni ko'rib chiqadi, shuningdek aralash infektsiya stsenariylarini istisno qiladi. O'qilgan genomning qamrovi 99% dan yaxshiroq (qo'shimcha 1-jadval).
Xaritalar va noto'g'ri SNPlar oldini olish uchun quyidagi hollarda variantni filtrlang: (1) u 20 dan kam ko'rsatkichlar bilan qo'llab-quvvatlanadi, (2) u 0,9 dan kam chastotada topiladi, (3) u kamida bitta shtammda, lekin hech bo'lmaganda boshqa shtammda bo'shliqlar mavjud. Integratsiyalashgan genomik ko'rish vositasi (IGV) 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 versiyasi SNP va pozitsiyalarni xaritalash yoki moslashtirish muammolari bilan vizual tekshirish uchun ishlatilgan. Prolin-glutamat (PE) va prolin-prolin glutamat (PPE) genlari yuqori darajada takrorlangan va ko'p genli oilaning bir qismi bo'lganligi sababli, ular Illumina ketma-ketligi va noto'g'ri xaritalash orqali osonlikcha noto'g'ri tushuniladi, shuning uchun ularga afzallik beriladi Mikobakterial bioinformatika ish oqimi SNP strategiyasini tasdiqlash uchun sil kasalligi kompleksi a'zolarini olib tashlaydi. Shuning uchun biz tahlildan PE/PPE genlari va indellarini filtrladik.
Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) ma'lumotlariga ko'ra, barcha SNPlar funktsional toifalarga bo'lingan. SnpEff quvur liniyasi (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP oqibatlarini (sinonim yoki sinonim bo'lmagan o'zgarishlar) aniqlash uchun ishlatiladi. Mycobacterium bovis AF2122/97 genomining yangi ma'lumotlar bazasi yaratildi (LT708304.1).
Yadro genomini ko'p tekislash Parsnp v1.2 yordamida amalga oshirildi, hozirda https://github.com/marbl/parsnp57 da mavjud bo'lib, 69 ta to'liq genom/qoralama yig'indisi (-c varianti bilan) va M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) mos yozuvlar sifatida ishlatiladi. To'rtta asosiy ko'p tekislash amalga oshirildi: faqat Eu2 klonlash kompleksining a'zolari (n = 37), shu jumladan Evropa klonlash kompleksining barcha a'zolari (n = 44), shu jumladan Evropa va Afrika klonlash kompleksining birlashma nuqtasi (n = 51) va ushbu tadqiqotga barcha Mycobacterium bovis (n = 70) kiradi.
Parsnp tomonidan yaratilgan asosiy hizalama RAxML yordamida CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 yordamida maksimal ehtimollik (ML) filogenetik daraxtini aniqlash uchun ishlatiladi va 1000 boshqariladigan replikatsiyalarni amalga oshiradi.
Parallel ravishda rekombinatsiya hodisalari mavjudligini tekshirish uchun uch xil algoritm va bioinformatika vositalaridan foydalaniladi: SplitsTree4 dasturiy ta'minoti, Gubbins (nukleotidlar ketma-ketligidagi rekombinatsiya orqali xolis nasl) quvur liniyasi va RDP4 (rekombinatsiyani aniqlash dasturi, beta 4.101 versiyasi).
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 da amalga oshirilgan split dekompozitsiya usuli statistik tekshirish uchun Phi testidan foydalanib, ildizsiz filogenetik tarmoqni hisoblash uchun ishlatiladi va ahamiyatlilik chegarasi p = 0,05. Parsnp ning asosiy ko'p tekislash tahlili kirish sifatida ishlatiladi va tarmoq standarti sifatida bo'linish dekompozitsiyasi amalga oshiriladi.
Gubbins quvur liniyasi v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 rekombinatsiyaning Mycobacterium bovisga ta'sirini baholashning yana bir usuli sifatida standart parametrlar bilan ishlaydi. Quvurda amalga oshirilgan algoritm tegishli klon nasl-nasabini qayta tiklaydi. AF2122/97, LT708304.1) o'zaro bo'lib, rekombinatsiya hodisasini ifodalovchi SNP klasterini aniqlash uchun daraxtning har bir novdasidagi SNP holatini skanerlang RAxML dan ML daraxti kirish fayllari sifatida ishlatiladi.
Nihoyat, Gubbins quvur liniyasi tomonidan taklif qilingan qayta tashkil etish hodisasini tasdiqlash uchun RDP467 da (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 va SiScan66) amalga oshirilgan oltita algoritm standart sozlamalar ostida Parsnp-ning asosiy bir nechta moslashuviga qo'llaniladi. Biz RDP4 da amalga oshirilgan algoritmlarning kamida uchtasi har bir rekombinatsiya hodisasini tekshirish uchun muhim signalni doimiy ravishda namoyish etishi kerakligini aniqladik.
Gubbins ham, RDP ham dasturiy ta'minot 500 bp gacha bo'lgan oynada yadroning bir nechta hizalanishini tekshirish orqali rekombinatsiya signallarini izlashini va de novo yig'ish paytida PE/PPE genlarining kiritilishi topilgan rekombinatsiya signallariga xalaqit bermasligini tasdiqlagan holda, keyingi tahlil homolinearlik orqali amalga oshiriladi. To'liq genomdan foydalangan holda sinlinear xarita mahalliy genom translokatsiyasi yoki inversiyasini istisno qilish uchun MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) yordamida tuzilgan. Bundan tashqari, butun genom SyntTax veb-server (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) orqali aminokislotalar ketma-ketligida gomolinearlik tahlilini o'tkazish uchun ishlatilgan.
Portugaliyaning ko'p mezbonli sil kasalligi tizimidan olingan genom ma'lumotlar to'plamini yanada chuqurroq tahlil qilish adabiyotda qayd etilgan genlarning polimorfizmini tekshirishdan iborat. Bu genlar 37,38 va HGT (DNK ta'mirlash, replikatsiya va rekombinatsiya) tizimi komponentlari orqali MTBC ajdodlari tomonidan olingan 3R ni kodlovchi gen. nukleotidlar xilma-xilligi (p) va Tajimaning D neytral test parametri kiritilishi.
69 ta Mycoplasma bovis izolatsiyasi va mos yozuvlar genomlari asosida maksimal ehtimollik (ML) filogenetik daraxti olindi (2A-rasm). Bir genga asoslangan daraxtlar yoki ko'p joyli daraxtlar bilan solishtirganda, bu strategiya butun genomning o'zgaruvchanligini qo'lga kiritmaydigan va shuning uchun 68,69 turlarni kamsitish qobiliyatini namoyish etmaydigan kuchliroq daraxtlarni yaratishga imkon beradi. ML daraxtining topologik tuzilishi odatda klonlarning murakkab tasnifiga mos keladi. Eu2 genomi filialda to'plangan va Af1 genomi ham birga to'plangan (2A-rasm). Natija, shuningdek, Mycobacterium bovisning ma'lum evolyutsion munosabatlariga mos keladi, ya'ni Eu1 a'zosi va boshqa barcha klonal komplekslar va genomlardan tashkil topgan guruh o'rtasida katta farq bor, lekin klonal kompleks 30 ko'rsatilmagan. Klonal kompleks va filogenetik daraxtda kuzatilgan munosabatlar o'rtasidagi kichik nomuvofiqlikni klonal kompleksning ma'lum genomik mintaqalar asosida tasvirlanganligi bilan izohlash mumkin, filogenetik daraxt esa butun genomni ifodalovchi yadro genomlarining bir nechta moslashuviga asoslangan.
Maksimal ehtimollik filogenetik daraxti (GTR) Mycobacterium bovis genomining asosiy genomini rekombinatsiya joyini olib tashlashdan oldin (A) va keyin (B) muvofiqlashtirish asosida tuzilgan. Filial ranglari Mycobacterium bovis klon majmuasini ifodalaydi: Yevropa 1 binafsha rang, Yevropa 2 qizil, Yevropa 3 ko‘k, Afrika 1 to‘q sariq va Afrika 2 yashil. Daraxt ildiz otadi va o'lchovga tortiladi va filial uzunligi har bir sayt uchun almashtirish sifatida o'lchanadi.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi klonal evolyutsiya sifatida tavsiflanadi va yillar davomida to'plangan dalillarning aksariyati davom etayotgan HGT va rekombinatsiya hodisalari MTBC15,17,18 aniqlanadigan darajada sodir bo'lmaydi degan fikrni qo'llab-quvvatlaydi.
Oldingi ishlar MTBC shtammlari 20,21 o'rtasida cheklangan rekombinatsiya bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi, boshqalari esa o'lchanadigan rekombinatsiya hodisalarini aniqlay olmadi70,71. Ushbu muammoni Mycobacterium bovisga e'tibor qaratib qayta muhokama qiling, bu faqat Mycobacterium tuberculosis 70,71 ko'rib chiqilgan oldingi ishdan farq qiladi; yoki MTBC ni bir butun sifatida ko'rib chiqing, deyarli M. bovis 20 ni ifodalamaydi; yoki faqat cheklovchi qoramol fraktsiyalarini hisobga oling. Mikobakteriyalar ma'lumotlar to'plami, bu ishda, rekombinatsiyani tekshirish uchun ishlatiladigan barcha klonal komplekslarni ifodalovchi jami 70 shtamm mavjud. Ma'lumotlar to'plami to'rtta kümülatif darajaga ko'ra masshtablangan: (1) Eu2 a'zolari, (2) barcha Evropa klon kompleksi a'zolari (ya'ni Evropa), (3) Evropa va Afrika klon kompleksi (Eu + Af) va (4) butun ma'lumotlar to'plamlari (shu jumladan, allaqachon tasvirlangan klonlash komplekslariga kiritilmagan genomlar).
Ushbu gipotezani qo'shimcha o'rganish uchun genomlar o'rtasida rekombinatsiya hodisalari yo'qligini baholash uchun split-parchalanish tarmog'i amalga oshirildi, chunki bu usul shaxslar o'rtasidagi ajdodlar munosabatlarini tasavvur qilishi va qarama-qarshi filogenetik signallarni ko'rsatishi mumkin. Tahlildagi barcha to'rtta ma'lumotlar to'plami tarmoqdagi halqalar mavjudligini tasdiqladi (ya'ni, bitta daraxtga birlashmaydigan joylar), ammo Phi testi statistik yordamga ega emas (Eu2, p = 0,0956; Evropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; butun ma'lumotlar to'plami p45 mavjudligini tasdiqlaydi). hodisalar (3A-D-rasm).
Evropada 2 genom (n = 37) (A), Evropa genomlari (n = 44) (B), Evropa va Afrika genomlari (n = 51) (C) va butun ma'lumotlar to'plami (n = 70) (D).
Ushbu tahlildan so'ng va barcha tarmoqlardagi tsiklik kuzatuvlarni hisobga olgan holda, Gubbins quvur liniyasida amalga oshirilgan rekonstruksiya algoritmi klonal naslni qayta tiklash va rekombinatsiyaning M. bovis genomiga ta'sirini baholashni to'ldirish uchun qo'llanildi. Rekombinatsiya hodisalarining umumiy sonini aniqlang, ularning aksariyati terminal shoxlarida (ya'ni bitta genomda) sodir bo'lgan (2-jadval). Bu ko'rsatkichlar butun ma'lumotlar to'plamining izchilligini ko'rsatadi va rekombinatsiya hodisalarining chastotasi mutatsiyalarga nisbatan 200 dan 300 martagacha ekanligini ko'rsatadi. Bir marta filialdagi rekombinatsiya va nuqta mutatsiyalarining nisbiy tezligini ifodalovchi rho/teta parametri 0,0037 va 0,0056 orasida ko'rinadi (3-jadval). Yaqinda 38 M. bovis shtammining nashr etilgan ishi ushbu ma'lumotlar to'plamida olinganidan ko'ra yuqoriroq rho / teta qiymatini (rho / teta = 0,1) ko'rsatdi, ammo Patané va uning hamkasblari ishi rekombinatsiya parametrlarini aniqlash uchun mos yozuvlar asosidagi yig'ilishdan foydalangan. terminal filiali.
Keyinchalik, r/m parametri rekombinatsiya va mutatsiyani kiritishning xilma-xillik nisbatini ifodalaydi va uning o'rtacha qiymati 0,025 va 0,037 orasida bo'ladi, bu mutatsiyalar bilan solishtirganda, rekombinatsiya M. bovisning genetik xilma-xilligiga umumiy ta'siri kamroq ekanligini ko'rsatadi (3-jadval)). Keng qamrovli taqqoslash uchun shunga o'xshash usul 23 genomdan tashkil topgan MTBC ma'lumotlar to'plamining o'rtacha qiymati 0,48620 ni ko'rsatuvchi r/m parametrini baholash uchun ishlatilgan, Patané va uning hamkasblarining 38 M. bovis ma'lumotlar to'plami uchun esa o'rtacha qiymat 0,98 ekanligini isbotladi. Birinchi tadqiqotda M. bovis (M. bovis BCG va mos yozuvlar shtammi) ishiga kiritilgan 23 ta genomdan faqat ikkitasi, shuning uchun olingan qiymat M. tuberculosis genomining haddan tashqari ko'payishi tufayli noto'g'ri bo'lishi mumkin. Ikkinchi hisobotda tahlil qilingan Mycobacterium bovis populyatsiyalari asosan Amerika Qo'shma Shtatlari va chorva mollari egalaridan topilgan. Bundan farqli o'laroq, bizning ma'lumotlar to'plamimizda ko'proq geografik joylashuvlar va xost turlari aks ettirilgan va turli xil populyatsiya genetik xususiyatlariga ega bo'lgan turli klonal komplekslarga guruhlangan genomlar ham qo'llaniladi, bu esa yanada chuqurroq va kengroq Populyatsiya bilimiga erishadi. Bizning ma'lumotlar to'plamimiz bilan olingan farq r / m o'rtacha qiymati bir xil taksonomik turlarga tayinlangan nasllar o'rtasida rekombinatsiya darajasi juda katta farq qiladi degan kontseptsiyaga mos keladi, shuning uchun bu natijalar M. bovis klon kompleksi rekombinatsiya farqlarini ko'rsatishi mumkinligini ko'rsatadi Ta'sir ham Didelot & Maiden tomonidan taklif qilingan72. Shunga qaramay, ko'proq M. bovis genomlarini kiritish orqali ushbu ma'lumotlar to'plamini sezilarli darajada kengaytirish bu fikrni yanada aniqlashtirish imkonini beradi. R/m va rho/teta parametrlari shoxlar orasidagi o'zgaruvchanlikni ko'rsatadi va bu natija boshqa bakterial turlar haqidagi hisobotlarga mos keladi72,73.
Nihoyat, Gubbins quvur liniyasi tomonidan aniqlangan qayta tashkil etish hodisalarini tasdiqlash uchun RDP4 dasturiy ta'minotida turli xil yadroli ko'p taqqoslashlarni mustaqil ravishda sinab ko'rish uchun oltita turli xil algoritmlardan foydalanildi. Global miqyosda Gubbins tomonidan aniqlangan hodisalarning yarmidan kamrog'i RDP4 tomonidan tasdiqlangan (4 va 5-jadvallar). Butun ma'lumotlar to'plamini hisobga olgan holda, uchta rekombinatsiya hodisasi tasdiqlandi, ikkitasi ichki tugunlar bilan, ikkinchisi esa terminal filialdagi bitta genomni o'z ichiga oladi, ular uchun klonal komplekslarni tayinlash mumkin emas (4 va 5-jadvallar). Terminal shoxlardagi hodisalarni aniqlash zamonaviy M. bovis shtammlarida rekombinatsiya hali ham davom etayotganligini yoki natija noto'g'ri ekanligini ko'rsatishi mumkin70. Ushbu gipotetik rekombinatsiya hududida pozitsiyalarning taxminan 20 foizi aniqlanmagan nukleotidlarga (N) ega, bu rekombinatsiya signaliga ta'sir qiladi (2-rasm). Bundan tashqari, bu mintaqa yuqori darajada saqlanib qolishi kutilayotgan 16S ribosoma RNKni kodlaydigan rrs geniga ta'sir qiladi, shuning uchun bu taxminiy rekombinatsiya signali ketma-ketlik xatolari yoki noto'g'ri hizalanish natijasi bo'lishi mumkin. Keyin Mb0003 va Mycobacterium bovis AF2122/97 o'rtasidagi butun genom moslashuvi amalga oshirildi va aniqlanmagan nukleotidlar va SNPlar mavjudligi tasdiqlandi, shuning uchun noto'g'ri hizalanish bilan bog'liq mumkin bo'lgan muammolar ushbu ishda amalga oshirilgan biologik ma'lumotlarga bog'liq emas edi.
Ichki tugunlarning rekombinatsiya hududlarida bo'shliqlar yoki aniqlanmagan nukleotidlar topilmadi (4 va 5-rasmlar). Ushbu hodisalarga kelsak, ulardan biri faqat Eu2 genomini o'z ichiga oladi va mumkin bo'lgan poliketid sintazasini kodlaydigan pks12 geniga ta'sir qiladi; ikkinchisi Eu1 genomida ro'yxatga olingan va mumkin bo'lgan nitrat reduktazasini kodlaydigan narX geniga ta'sir qiladi (4-jadval). Umuman olganda, rekombinatsiya tahlili shuni ko'rsatadiki, statistik ma'lumotlarga ega bo'lgan cheklangan miqdordagi rekombinatsiya fragmentlari mavjud va xulosa qilingan ko'rsatkichlar rekombinatsiyaning M. bovis nasliga past ta'sir ko'rsatishini ko'rsatadi. Rekombinatsiya signali past bo'lishi kutilmoqda, ammo haqiqiy evolyutsiya signalini fon shovqinidan ajratish muhim, bu qiyin vazifadir. Malumotga asoslangan yig'ish va mos kelmaslik muammolari 70, 71 tomonidan kiritilgan shovqin signalini kamaytirish uchun to'liq genomdan tashqari qolgan barcha narsalar noldan yig'ildi va yig'ish sifati QUAST quvur liniyasi tahlili bilan tekshirildi va ta'minlandi (1-jadval). Bundan tashqari, umumiy so'rovning ishonchliligi va aniqligini ta'minlash uchun bir qator qo'shimcha tahlillar o'tkazildi. Shuning uchun, narX va pks12 genlarining ketma-ketlik sifati Mycobacterium bovis AF2122/97 ga qarshi o'qish xaritasi orqali baholandi. Rekombinatsiya hududida tavsiya etilgan SNP pozitsiyasi usul bo'limida ko'rsatilgan mezonlarni qo'llash orqali tasdiqlangan (kamida 20 o'qish va 0,9 o'zgarish chastotasi). NarX genining polimorfizmi ikkita genomda (Mb1792361 va Mb7240415; 2,3%) va pks12 genomlari genomlarida to'liq tasdiqlangan: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb170415. Biroq, Mb2043 genomi uchun sakkizta pozitsiyadan oltitasi o'qish chuqurligi mezoniga javob bermaydi, chunki SNP maksimal 17 o'qish bilan qo'llab-quvvatlanadi, bu belgilangan chegara qiymati 20 dan pastdir. Shuning uchun, ushbu genom saytida olti genomning (8,6%) rekombinatsiyasini tasdiqlash mumkin (45-rasm).
Mycobacterium bovis ma'lumotlar to'plamining rekombinatsiya mintaqasi moslashuvining batafsil vizualizatsiyasi mumkin bo'lgan nitrat reduktazasini kodlaydigan narX geniga ta'sir qiladi. Ichki tugunlarning rekombinatsiya hududida bo'shliqlar yoki aniqlanmagan nukleotidlar topilmadi. Ushbu maxsus hodisa Eu1 genomida qayd etilgan. NarX genining ketma-ketlik sifati Mycobacterium bovis AF2122/97 ko'rsatkichlarini tuzish orqali baholandi. Usul bo'limida ko'rsatilgan mezonlarni (kamida 20 o'qish va 0,9 o'zgarish chastotasi) qo'llash orqali rekombinatsiya hududida tavsiya etilgan SNP manzilini tasdiqlang. NarX genining polimorfizmi Mb1792361 va Mb7240415 (2,3%) genomlarida to'liq tasdiqlangan.
Pks12 geniga ta'sir qiluvchi Mycoplasma bovis ma'lumotlar to'plamining rekombinatsiya mintaqasi moslashuvining batafsil vizualizatsiyasi. Ichki tugunlarning rekombinatsiya hududida bo'shliqlar yoki aniqlanmagan nukleotidlar topilmadi. Mumkin bo'lgan poliketid sintazasini kodlaydigan pks12 geniga ta'sir qiladigan hodisaga kelsak, u faqat Eu2 genomini o'z ichiga oladi. Pks12 ning ketma-ketlik sifati Mycobacterium bovis AF2122/97 ning o'qilgan xaritasi orqali baholandi. Usul bo'limida ko'rsatilgan mezonlarni (kamida 20 o'qish va 0,9 o'zgarish chastotasi) qo'llash orqali rekombinatsiya hududida tavsiya etilgan SNP manzilini tasdiqlang. Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 va Mb1960 genomlarining polimorfizmlari to'liq tasdiqlangan.
PE va PPE genlarida Illumina sekvensiyasi va noto'g'ri xaritalash orqali osongina noto'g'ri o'qiladigan takrorlanuvchi hududlar mavjud, shuning uchun ular odatda M. tuberculosis a'zolarining bioinformatika ish oqimidan faqat ketma-ketlikni xaritalash strategiyasidan foydalanganda o'chiriladi. Ushbu ishda qo'llaniladigan rekombinatsiya hodisalari xulosasi PE/PPEni filtrlamasdan de novo yig'ishga asoslangan. SplitsTree, Gubbins quvur liniyasi va RDP4 dasturiy ta'minoti orqali uchta turli xil qo'shimcha usullar va algoritmlarni amalga oshirish orqali qo'llaniladigan strategiyalar xato signallari tufayli qayta tashkil etilgan hududlarni qayta ishlash va filtrlash uchun mustahkam ekanligiga ishonamiz. Biroq, SNP klasterlarini aniqlash uchun Gubbins va RDP4 dasturiy ta'minotiga PE / PPE genining aralashuvini istisno qilish va shuning uchun narX va pks12 genlariga ta'sir qilish uchun tavsiya etilgan rekombinatsiya hududlarini aniqlash uchun ushbu genlarning qo'shniligi tekshirildi (Qo'shimcha rasm. 3-5). M. bovis AF2122/97da narX geni narK2 va Mb1764c bilan ajratilgan, pks12 esa Mb2075c e Mb2073c bilan o'ralgan (qo'shimcha rasm 3-5). To'liq genomning MAUVE sinline xaritasi yordamida yaratilgan xarita genlar ketma-ketligini saqlash va qayta tashkil etish haqida ma'lumot beradi, to'rtta kollinear blokni ko'rsatadi va genomning translokatsiyasi yoki inversiyasi belgilari yo'q. Bundan tashqari, aminokislotalar ketma-ketligi bilan komplementatsiya tahlili barcha to'liq genomlarda homologiyani isbotladi va narX yoki pks12 ning qo'shni hududlarida PE/PPE topilmadi. NarX uchun bitta genom (Mb0030) pastroq sinonimiya balliga ega, chunki narX geni ikkita fragment (1891 va 1890 parchalari) sifatida aniqlangan. Pks12 uchun o'xshashliklar tufayli Mb0030 va Mb003 pastroq sinlinearlik ko'rsatkichlarini namoyish etdi, pks12 esa mos ravishda oqsilning turli sohalarini ifodalovchi ikki va uchta bo'laklarda aniqlandi (Qo'shimcha rasm 3-5). Ushbu ma'lumotni hisobga olgan holda va Gubbins va RDP4 dasturiy ta'minoti ikkalasi ham tahlilni amalga oshiradi, oynada maksimal 500 bp ning yadro bir nechta moslashuvini tekshiring, biz PE / PPE geni narX va pks12 ga ta'sir qiluvchi rekombinatsiya signaliga xalaqit bermasligini tasdiqladik.
Ushbu ma'lumotlar to'plamida aniqlangan rekombinatsiya signallari qoldiq deb hisoblanishi mumkin bo'lsa-da, M. bovisdagi rekombinatsiyani inkor etib bo'lmaydi, shuning uchun u keyingi tahlil mavzusi bo'lib qolishi kerak, bunda turli epidemiologik stsenariylarning butun genomlari Muhimga ketma-ket joylashtiriladi.
Rekombinatsiyani tuzatishdan oldin va keyin olingan ML filogenetik daraxtlarini solishtirish (2A, B-rasm) xulosa qilingan filogenetik munosabatlarda sezilarli o'zgarishlarga olib kelmadi va M. bovis shtammlari bir xil guruhda to'plangan.
M. bovis AF2122/97 mos yozuvlar genomi bilan 42 ta yangi ketma-ket M. bovis o'qishini xaritalashdan so'ng, 1816 polimorf pozitsiyani o'z ichiga olgan SNP moslashuvi olindi. Ko'pgina SNPlar (87,1%) kodlash hududida joylashgan va ta'sirlangan genlar Bovilistda ko'rsatilgan funktsional toifalarga ko'ra tavsiflanadi (6A, B-rasm). Har bir funktsional toifadagi genlarning umumiy sonini hisobga olgan holda, "lipid almashinuvi" toifasidagi genlar ko'proq SNP ni ko'rsatdi, keyin esa "hujayra devori va hujayra jarayonlari" va "oraliq metabolizm va nafas olish" ularning M. bovis evolyutsiyasida ekanligini aniqladi.
Portugaliyadan M. bovis ma'lumotlar to'plamining ierarxik tahlili (n = 42). Har bir funktsional toifa (A) uchun ro'yxatga olingan SNP va ta'sirlangan genlarning umumiy soni. Funktsiya toifasi (B) bo'yicha ro'yxatga olingan sinonim va sinonim bo'lmagan o'zgarishlarning umumiy soni.
Global miqyosda o'rtacha dN / dS nisbati 1,5 dan yaxshiroq, bu global evolyutsion bosimning ajdodlar holatidan xalos bo'lish ekanligini ko'rsatadi va ijobiy (diversifikasiyalangan yoki yo'naltirilgan) va / yoki bo'shashgan tozalashni tanlash stsenariysini ifodalaydi. "Virulentlik, detoksifikatsiya, moslashish", "qo'shish ketma-ketligi va faglar" va "tartibga soluvchi oqsillar" toifalarida SNP ning uchdan ikki qismidan ko'prog'i sinonim emas (6B-rasm).
Barcha toifalarda bir nechta SNPga ega genlar mavjud bo'lib, natijada o'rtacha mutatsiya tezligi (ya'ni, har bir gen uchun o'rtacha SNP) 1 dan yuqori (6A-rasm). 15 SNPli Pks12 (Mb2074c) va 8 SNPli fas (Mb2553c) yuqori mutatsiya qiymatlariga ega. Bu ikkala gen ham yog 'kislotalari almashinuvida ishtirok etadi. Pks geni mikobakterial hujayra devori lipid biosintezida ishtirok etuvchi ko'p funksiyali ferment bo'lgan poliketid sintazani (PKS) kodlaydi74,75. Bu gen mikoketidlar sintezida ishtirok etuvchi ko'p funksiyali polipeptidni kodlaydi74,76. Fas geni mikolik kislota sintezida ishtirok etadi. Bu ikkala gen ham uy egasi bilan aloqada bo'lgan hujayra devorining biosintezida muhim rol o'ynaydi.
Mycobacterium bovis evolyutsiyasini qo'shimcha o'rganish uchun ikkita maxsus genlar to'plami tahlil qilindi. Ketma-ketlik tarkibi va filogenetik usullardan foydalangan holda ilgari nashr etilgan ishlar diversifikatsiyadan oldin HGT orqali MTBC ajdodlari tomonidan sotib olingan genlarni aniqladi37,38. Ushbu genlar 2-qo'shimcha jadvalda keltirilgan. HGT bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan jami 77 genning SNP taqsimoti tahlil qilindi va 26 ta polimorf joy aniqlandi, bu ko'p hollarda (78%) sinonim bo'lmagan (NS) o'zgarishlarga olib keldi (2-jadval). MTBC genomi bo'yicha oldingi ishlar shuni ko'rsatdiki, taxminiy HGT mintaqasi genomning qolgan qismiga nisbatan yuqoriroq NS SNP nisbatini namoyish etadi. Agar kimdir bu rekombinatsiya hududlari MTBC ajdodlari tomonidan olingan deb hisoblansa va shuning uchun ular qadimgi polimorfizmlarni haddan tashqari ifodalaydi, u holda sinonimik o'zgarishlarning nisbati yuqori bo'lishi kutiladi, chunki NS o'zgarishlari aminokislotalarning o'zgarishi tufayli salbiy tanlanish yo'li bilan yo'q qilinishi kutiladi. Oqsil funktsiyasini o'zgartirishi mumkin. Shu sababli, bizning natijalarimiz funktsional oqibatlar HGT-ga o'xshash genlarni almashtirishdan kelib chiqishi mumkinligini ko'rsatadi, bu ularning qimmatli adaptiv genetik xilma-xillik uchun ahamiyatini aks ettiradi.
Ushbu tahlil bilan parallel ravishda, 3R (DNK ta'mirlash, replikatsiya va rekombinatsiya) tizimining tarkibiy qismlarini kodlovchi genlar avvalroq dos Vultos va hamkorlar (2008) tomonidan e'lon qilingan ro'yxatga muvofiq sinchkovlik bilan tekshirildi39. Bir xil DNK bo'laklarining almashinuvini bevosita kuzatish mumkin emas, garchi bu yaqindan bog'liq bakteriyalar ishtirok etganda tez-tez sodir bo'ladigan jarayon bo'lishi mumkin, masalan, ushbu ma'lumotlar to'plamida; bundan tashqari, bu jarayon DNKni ta'mirlash usullarining kaliti bo'lishi mumkin72, shuning uchun gomologik rekombinatsiyada rol o'ynang. 54 gen tomonidan taqsimlangan jami 26 ta polimorf pozitsiya aniqlandi (qo'shimcha 3-jadval). Ushbu genlar to'plamida NS o'zgarishlari oqibatlarning taxminan 65% ni tashkil etdi, bu Mycobacterium tuberculosis shtammlari haqidagi oldingi hisobotlarga mos keladi.
Yuborilgan vaqt: 21-oktabr-2021