Tack för att du besöker Nature. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en nyare version av webbläsaren (eller stänger av kompatibilitetsläget i Internet Explorer). Samtidigt, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att visa webbplatser utan stilar och JavaScript.
Genomsekvensering har återupplivat forskningen om infektionssjukdomar och avslöjat sjukdomsepidemiologi, patogenes, interaktioner mellan värd och patogen och den evolutionära process som påverkar patogener. Mycobacterium tuberculosis-komplexet (MTBC) betraktar Mycobacterium bovis som en av sina anlagda medlemmar som orsakar tuberkulos (TB) hos landlevande däggdjur, och är en typisk modell för bakteriell evolution. Liksom andra MTBC-medlemmar antas Mycobacterium bovis vara en strikt klonad, långsamt utvecklande patogen, och det finns uppenbarligen inga tecken på rekombination eller horisontell genöverföring. I detta arbete tillämpar vi jämförande genomik på en helgenomsekvensdatauppsättning (WGS) bestående av 70 nötkreatur M. från olika stamtavlor (Europa och Afrika) för att få insikter i den genetiska mångfalden hos nötkreatur M. Evolutionär kraft. Tre olika metoder används för att uppskatta tecken på omorganisation. Globalt har ett litet antal rekombinationshändelser identifierats och bekräftats med två oberoende metoder med starkt stöd. Jämfört med mutationer har rekombination dock en svagare effekt på mångfalden hos M. bovis (total r/m = 0,037). Skillnaden i r/m-medelvärde som erhölls i det klonala komplexet av Mycobacterium bovis i vår datamängd överensstämmer med den allmänna uppfattningen att graden av rekombination kan variera kraftigt mellan linjer som tillskrivs samma taxonomiska art. Baserat på detta arbete kan rekombination i Mycobacterium bovis inte uteslutas, så det bör vara föremål för ytterligare ansträngningar i framtida jämförande genomforskning, där arbetsgruppsanalyser av stora datamängder från olika epidemiologiska scenarier runt om i världen är avgörande. En ytterligare analys utfördes sedan på den mindre Mycobacterium bovis-datamängden (n = 42) från prevalensen av multivärd-TB, och mer än 1 800 loci identifierades, varav minst en stam uppvisade en enkelnukleotidpolymorfism (SNP). De flesta (87,1 %) är belägna i den kodande regionen, och det globala förhållandet mellan icke-synonyma förändringar (dN/dS) av synonyma förändringar överstiger 1,5, vilket indikerar att positiv selektion är en viktig evolutionär kraft som utövas på M. bovis. En högre andel SNP:er detekterades i gener rika inom funktionella kategorier som "lipidmetabolism", "cellvägg och cellulära processer" samt "mellanliggande metabolism och respiration", vilket avslöjar deras potential inom biologin och evolutionen av Mycobacterium bovis betydelse. En närmare titt på generna i MTBC-förfäderna som är benägna att utföra horisontell genöverföring och inkluderade i 3R-systemet (DNA-reparation, replikation och rekombination) avslöjar det globala genomsnittliga negativa värdet av Taijimas D-neutrala test, vilket indikerar tidigare selektiv skanning. Den senaste flaskhalsen efter populationsexpansion är fortfarande den viktigaste evolutionära drivkraften för den obligatoriska patogenen Mycobacterium bovis att bekämpa värden.
Mycobacterium tuberculosis-komplexet (MTBC) är en av de mest framgångsrika taxona av bakteriella patogener och ett typiskt fall av bakteriell evolution. Dess medlemmar uppvisar förvånansvärt hög nukleotididentitet på genomisk nivå (> 99%)1,2. Olika MTBC-ekotyper kan orsaka tuberkulos (TB), som är en infektiös granulomatös sjukdom, hos ett brett spektrum av värdarter från mikrodäggdjur till människor3,4,5. För närvarande inkluderar komplexet människor [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] och djuranpassade patogener (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" och "dassie")5,6. M. canettii (även känd som "Nodobacter glabrata") Den genomsnittliga nukleotididentiteten med de ovannämnda mykobakterierna är 98 %, och jämförande genomforskning har visat att M. canettii och resten av MTBC nyligen har avvikit från den gemensamma förfadern.7 Med tanke på detta koncept kallar vissa författare M. canettii för medlem av MTBC 8.
MTBC beskrivs systematiskt som ett strikt klonalt komplex, och dess populationsstruktur styrs tydligt av minskad mångfald, flaskhalsar, selektiv skanning och genetisk drift9,10. Om man antar att komplex strikt klonal evolution, såsom saknade polymorfismer, inte kan återställas genom rekombination. Baserat på denna premiss har de på varandra följande händelserna av genomisk deletion av den differentiella regionen (RD) och TbD1 (Mtb-specifik deletion 1-region) föreslagits som molekylära markörer för MTBC-evolution2,5,11. Jämförande genomik och helgenomsekvenseringsarbete (WGS) stöder uppdelningen av mänskligt anpassade medlemmar i nio linjer (Mycobacterium tuberculosis L1 till L4, L7 och L8; och Mycobacterium africanum L5, L6 och L9), linjerna L2 till L4 delade deletionen av TbD1-regionen2,11,12,13. Dessutom föreslås att djuranpassade medlemmar delar en gemensam förfader, vilket definieras av kladspecifika deletioner i RD7, RD8, RD9 och RD102, 5 och 14.
Horisontell genöverföring (HGT) och rekombinationshändelser anses vara sällsynta och förekommer hos MTBC:s förfäder, snarare än den olika historien hos hela MTBC-medlemmen15,16,17. Två tidiga rapporter av Hughes och medarbetare (2002) och Gutacker och medarbetare (2006) föreslog att rekombinationshändelser kan bidra till att forma polymorfismer som markerar specifika loci i M. tuberculosis-stammar18,19. Orsakerna till den uppenbara bristen på rekombination i MTBC är: (1) den mekaniska processen och förlusten av HGT:s förmåga; (2) sällsyntheten hos HGT-händelser; (3) det finns ingen chans för rekombinationshändelser i MTBC-nischen14,17. Nyligen har vissa helgenomsekvenseringsstudier (WGS) tillämpade på MTBC-stam 20 och Mycobacterium bovis 21 gett bevis för rekombination, de första som visar att MTBC-stammar ofta utbyter små DNA-fragment, men på grund av begränsad variation i nukleotidsekvensen har dessa händelser fortfarande inte uppmärksammats.
Mycobacterium bovis är den vanligast förekommande MTBC-medlemmen från boskap (främst nötkreatur), även om den också kan isoleras från frigående och inhägnade vilda djur4,22,23,24. M. bovis utvecklades till fem stora klonala komplex [Europeisk 1 (Eu1), Europeisk 2 (Eu2), Europeisk 3 (Eu3), Afrikansk 1 (Af1) och Afrika 2 (Af2)], enligt spoligotypningsprofilen, specifika deletioner och enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP)25, 26, 27, 28, 29 i specifika gener. Dessa klonala komplex visar den mångsidiga strukturen hos Mycobacterium bovis-populationen och dess association med geografiska regioner. Dessutom utformade det senaste WGS-arbetet som utfördes av Zimpel och medarbetare (2020) en fylogeni baserad på SNP:n hos Mycobacterium bovis, med mer än 1 900 genom, vilket indikerar att det finns minst fyra olika linjer (benämnda Lb1 till Lb1 till Lb4). De är inte helt förenliga med det tidigare definierade klonala komplexet, även om geografisk specificitet också kan bekräftas30. Dessa författare utförde differentiell analys av fylogeni och molekylär datering, men studerade inte rekombination30.
Tidigare arbete med olika molekylära tekniker, såsom spoligotypning, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), och nyligen genomförd SNP-typning avslöjade en viss nivå av genetisk mångfald bland M. bovis-stammar 31, 32, 33, 34, 35. Differentiering av genetisk variation har blivit ett viktigt verktyg i studiet av sjukdomsepidemiologi, vilket är användbart för en djupgående förståelse av patogenes, virulens och sjukdomsöverföring. Framväxten av WGS-metoden ger möjlighet att avslöja de evolutionära drivande faktorer som Mycobacterium bovis-genomet påför i processen för anpassning och persistens till olika värdar och epidemiologiska scenarier.
I detta arbete använder vi jämförande genomisk analys på olika Mycoplasma bovis-dataset (n = 70), inklusive isolat från olika klonala komplex, för att få insikter i den evolutionära processen för Mycoplasma bovis, särskilt för att lösa fylogenetiska släktskap och rekombinationshändelser. Som ett komplement till denna analys undersöktes en deldataset av M. bovis-isolat (n = 42) erhållna från ett välkarakteriserat område med flera värdtuberkuloser i Portugal 31,36 ytterligare för att dra slutsatser om icke-identitet. Balansen mellan det relativa förhållandet mellan sense (dN) och synonyma (dS) nukleotidsubstitutioner, såväl som det evolutionära bidraget från specifika genom som nämns i litteraturen, de 37,38 erhålls av MTBC-förfäder genom HGT, och kodar för 3R-systemgenkomponenter (DNA-reparation, replikation och rekombination) 39. Välj gener erhållna genom HGT eftersom de kan representera forntida polymorfismer, så det förväntas att de kan innehålla en högre andel synonyma förändringar. Generna som ingår i 3R-systemet valdes ut eftersom tidigare arbete med M. tuberculosis-stammar indikerade generella negativa/reningsselektioner som verkar på dessa gener, och de kan spela en viktig roll i evolutionen 39. Ett annat mål med detta arbete är att dra slutsatser om förekomsten av omorganisationshändelser. Av denna anledning, med tanke på att vår dataset från Portugal endast innehåller genomerna för det europeiska klonkomplexet 2 och de stammar som inte har tilldelat klonkomplexet, beslutade vi att inkludera offentligt tillgängliga genomdata för att äntligen få en representativ bild av alla klonkomplex och förbättra resultatens robusthet och bredd.
42 nyligen sekvenserade Mycoplasma bovis-genom från den portugisiska endemiska multivärdtuberkulosscenen (detaljer nedan), som tidigare karakteriserats ur ett epidemiologiskt perspektiv36, står i centrum för detta arbete. Med tanke på att datamängden från Portugal endast innehåller representanter för de europeiska 2 klonkomplexen och stammar utan utsedda komplex, har offentligt tillgängliga helgenomsekvenseringsdata lagts till för att utöka datamängden som inkluderar alla representanter för M. bovis-klonkomplexen. Därför användes tre helgenomsekvenseringsdatakällor i detta arbete: komplett/utkast till genomsammansättning, upp till 10 scaffolds lagrade i NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolat); lagrade i SRA (Illumina fastq-filen i sekvensläsningsarkivet) representerar den komplexa mångfalden av M. bovis-kloner (n = 12 isolat)30; och 42 nyligen sekvenserade genom från Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) exkluderades från NCBI-sökningen. M. bovis AF2122/97 används vanligtvis som ett referensgenom som ska inkluderas i datamängden. På grund av den offentliga otillgängligheten av hela genomsekvensen som representeras av kloningskomplexet African 1, och det lilla antalet genom från representativa stammar av Af2 och Eu1, användes de ursprungliga sekvenseringsdata som tillhandahållits av SRA i dessa fall. Zimpel och hans medarbetares arbete (2020) hjälpte till att identifiera genomet från det tidigare nämnda kloningskomplexet och hjälpte till att välja Mycobacterium bovis för inkludering i datamängden. För Eu3 beskrivs endast en typ av genom (Branger et al., 2020), så det genom vi inkluderar är en separat representant för Eu3-komplexet.
Globalt inkluderar denna datamängd 70 arter av M. bovis från nötkreatur isolerade från 8 värdarter, fördelade i 12 länder från 1985 till 2016. 36 arter är betecknade som Eu2, 7 arter är Eu1, 1 art är Eu3, 3 arter är Af1, 4 arter är Af2 och 19 kan inte tillskrivas något klonalt komplex (detaljer nedan). Den detaljerade informationen (inklusive accessionsnummer) om Mycobacterium bovis som användes i denna studie visas i tabell 1 och kompletterande tabell 1.
42 nyligen sekvenserade helgenom av Mycobacterium bovis från Portugals hotspots för djurtuberkulos och distribuerade under mer än 12 år står i centrum för denna studie, eftersom potentiella system för sjukdomar mellan vilda djur och boskap regelbundet har övervakats 31,36 (kompletterande figur 1). Enligt efterföljande procedurer isolerades dessa stammar från nötkreatur (n = 14), kronhjort (n = 16) och vildsvin (n = 12) från 2003 till 2015: samla in och hantera djuren i enlighet med de rekommenderade protokollriktlinjerna. Vävnadsproverna finns i OIE:s handbok för landdjur och inokuleras på fast och flytande medium av Stonebrink och Löwenstein-Jensen pyruvat. Kulturerna inkuberas vid 37 °C och tillväxten kontrolleras en gång i veckan i minst 12 veckor. Kolonierna förvaras direkt i en glycerollösning vid -80 °C. I det Mycobacterium-selektiva mediet (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) passerade de ursprungliga arkiverade proverna genom en enda in vitro-passage in vitro för att erhålla DNA från WGS-programmet. För detta ändamål berikades den frysta kulturstamlösningen med 5 % natriumpyruvat och 10 % ADS (50 g albumin, 20 g glukos, 8,5 g natriumklorid i 1 liter vatten) på Middlebrook 7H9 vid 37 °C Retrain. Efter 4 veckors tillväxt förnyades mediet och kulturen övervakades regelbundet tills tillväxt observerades. Cellerna skördades genom centrifugering, pelleten resuspenderades i 500 µl fosfatbuffrad saltlösning (PBS), värmdes vid 99 °C i 30 minuter, centrifugerades och supernatanten förvarades vid -20 °C fram till WGS. Alla procedurer utförs i biosäkerhetsanläggningar av nivå 3.
WGS-biblioteket med parade ändar framställs med hjälp av det unika indexet för varje DNA-prov och använder Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 prover) och HiSeq (2 × 150 pb) (två isolat)-teknik (Eurofins Genomics, Tyskland) för sekvensering. Enligt tillverkarens instruktioner, använd Illumina Genome Analyzer med dubbeländad modulfäste för att sekvensera det genomiska DNA:t och använd Nextera XT DNA Library Prep Kit från Illumina för att konstruera biblioteket.
Med hänsyn till data som återhämtats från SRA (n = 12) kan identifieringen av klonkomplexet användas som metadata för motsvarande publikation 30, 41, 43. När man betraktar det fullständiga genomet, med undantag för Mycobacterium bovis AF2122/97 och Mycobacterium bovis 3601, vilka är erkända medlemmar av klonkomplexen Eu1 respektive Eu3 25, 29, är det detsamma som det fullständiga genomet för Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-accessionsnummer NC_000962.3). Genomjustering utförs med hjälp av MAFFT (multiple alignment program of amino acid or nucleotide sequence, version 7.458) och parametern -addfragments 48. Sök sedan efter frånvaron av olika klonala komplex och/eller förekomsten av SNP-funktioner.
Den nyligen sekvenserade Mycobacterium bovis (n = 42) och de ursprungliga avläsningarna av det sammansatta genomutkastet (n = 3) anpassar komplexet till referensgenomet Mycobacterium tuberculosis H37Rv genom vSNP-pipelinen och förekomsten av deletioner och/eller SNP-funktioner hos olika kloner. En sökning genomfördes.
Samla in information från avsaknaden av egenskaper och/eller närvaron/frånvaron av SNP och spoligotypningsprofiler för att tilldela genomiska data till motsvarande klonala komplex. För de fyra utkastsaggregaten kan spoligotypningsprofilen inte härledas, så de ingår i gruppen "ingen komplexitet".
Det bioinformatiska arbetsflödet som följs av detta arbete börjar med de novo-assemblage och mappning till en referensstrategi, med målet att utforska rekombinationshändelser och specifika genompolymorfismer. Figur 1 visar ett flödesschema över de steg som följs. För rekombinationsanalys används alla genom för att öka robustheten hos slutsatser och relaterade indikatorer.
För att minska fel i genereringen av genomkonsensussekvenser erhöll vi först de novo-assembling och sedan core multiple alignments. Unicycler-pipelinen finns för närvarande tillgänglig på https://github.com/rrwick/Unicycler49 och används för att utföra de novo-assembling av 54 sekvenserade genom (42 nyligen sekvenserade och 12 fastq-filer återställda från SRA). Kort sagt, innan assembleringen från grunden utfördes en läskvalitetsanalys i FastQC version 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) och Trimmomatic version 0.36 (alternativen "cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads" och "Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20" tillämpas) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Därefter användes SPAdes optimizer49 för genomassembling och Pilon version 1.1851 användes för optimering efter assembleringen. Ett konservativt bryggningsläge valdes för att undvika felaktig montering, och k-merstorleken söktes och valdes mellan 20 % och 95 % av läslängden. Följ SPAdes-riktlinjerna och beakta lässtorleken, radera contigs mindre än 300 bp och etablera en gräns på 52 för djup på 20 läsningar. I de novo-monteringsstrategin togs inte genomiska regioner såsom de mycket repetitiva prolin-glutamat (PE) och prolin-prolin-glutamat (PPE) paralogerna bort.
Kvaliteten på de novo-sammansättningen bedöms genom QUAST-pipelinen (http://quast.sourceforge.net/quast.html), vilket underlättar förnyelsen av contig och M. bovis AF2122/97-referensgenomet (NCBI-anslutningsnummer LT708304.1) kartläggning (se kompletterande tabell 1 för kvalitetsparametrar).
Med hjälp av vSNP-pipelinen (https://github.com/USDA-VS/vSNP) jämförs FASTQ-filen för den nyligen sekvenserade M. bovis från Illumina-sekvensering med M. bovis AF2122/97-referensgenomet (LT708304.1)). Enligt rekommendationerna för bästa praxis från Genome Analysis Toolkit (GATK) [53, 54, 55] används standardfilterparametrar eller variantmasspoäng för omkalibrering. Resultaten filtreras med hjälp av den lägsta SAMtools-masspoängen på 150 och AC = 2. Använd även Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) för att kontrollera avläsningarna och utesluta kontaminering. vSNP-pipelinen som används för att mappa till sekvenseringsstrategier i vårt arbete undersöker en serie definierade SNP:er och mål, och utesluter även blandade infektionsscenarier. Den avlästa genomtäckningen är bättre än 99 % (kompletterande tabell 1).
För att undvika kartläggningsfel och felaktiga SNP:er, filtrera bort en variant i följande fall: (1) den stöds av färre än 20 avläsningar, (2) den hittas med en frekvens på mindre än 0,9, (3) den finns i minst en stam, men det finns åtminstone luckor i en annan stam. Integrated Genomics Viewer (IGV) version 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 användes för att visuellt verifiera SNP:er och positioner med kartläggnings- eller inriktningsproblem. Eftersom prolin-glutamat (PE) och prolin-prolin-glutamat (PPE) generna är starkt duplicerade och är en del av en familj med flera genen, missförstås de lätt av Illumina-sekvensering och felmappning, så de är att föredra. Det mykobakteriella bioinformatiska arbetsflödet tog bort medlemmar av tuberkuloskomplexet när strategin att kartlägga till sekvensering användes för att bekräfta SNP:er. Därför filtrerade vi bort PE/PPE-gener och indels från analysen.
Enligt Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) är alla SNP indelade i funktionella kategorier. SnpEff-pipelinen (https://pcingola.github.io/SnpEff/) används för att utläsa SNP-konsekvenser (synonyma eller icke-synonyma förändringar). En ny databas över Mycobacterium bovis AF2122/97-genomet (LT708304.1) skapades.
Den multipela uppriktningen av kärngenomet utfördes med hjälp av Parsnp v1.2, för närvarande tillgänglig på https://github.com/marbl/parsnp57, med 69 kompletta genom/utkast-assemblies (med alternativ -c) och M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) används som referens. Fyra multipela uppriktningar av kärngenomet utfördes: endast medlemmarna i Eu2-kloningskomplexet (n = 37), inklusive alla medlemmar i det europeiska kloningskomplexet (n = 44), inklusive övergångspunkten för det europeiska och afrikanska kloningskomplexet (n = 51), och inkluderar alla Mycobacterium bovis i denna studie (n = 70).
Kärnaligneringen som genereras av Parsnp används för att härleda det fylogenetiska trädet för maximal likelihood (ML) med hjälp av CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 med RAxML, och utföra 1000 guidade replikationer.
Tre olika algoritmer och bioinformatiska verktyg används för att kontrollera förekomsten av parallella rekombinationshändelser: SplitsTree4-programvaran, Gubbins-pipeline (objektiv avstamning genom rekombination i nukleotidsekvenser) och RDP4-programvaran (rekombinationsdetektionsprogram, version beta 4.101).
Den splittade dekompositionsmetod som implementerats i SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 används för att beräkna det rotlösa fylogenetiska nätverket, med hjälp av Phi-test för statistisk verifiering, och signifikansgränsen är p = 0,05. Den centrala multi-alignment-analysen av Parsnp används som indata, och splittade dekompositionen som en nätverksstandard realiseras.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) körs med standardparametrar som ett annat sätt att utvärdera effekten av rekombination på Mycobacterium bovis. Algoritmen som implementerats i pipelinen rekonstruerar den relevanta klonlinjen. Den kompletta genom-/utkastsammansättningen av vår dataset och referensgenomet (nötkreatur AF2122/97, LT708304.1) är ömsesidigt anpassade; och skannar positionen för SNP på varje gren av trädet för att detektera SNP-klustret som representerar rekombinationshändelsen. Grenens nollpunkt Antag att det inte finns någon rekombinationshändelse, vilket innebär att de SNP:er som förekommer på grenen bör vara jämnt fördelade. Kärnmultiplikationen från Parsnp och det bäst poängsatta ML-trädet från RAxML används som indatafiler.
Slutligen, för att bekräfta den omorganisationshändelse som föreslås av Gubbins pipeline, tillämpas de sex algoritmerna som implementerats i RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 och SiScan66) på Parsnps kärnmultipla alignment under standardinställningar. Vi fastställde att minst tre av algoritmerna som implementerats i RDP4 konsekvent måste visa en viktig signal för att verifiera varje rekombinationshändelse.
Med tanke på att både Gubbins och RDP-programvaran letar efter rekombinationssignaler genom att kontrollera de multipla kärninriktningarna i ett fönster på upp till 500 bp, och bekräfta att inkluderingen av PE/PPE-gener under de novo-assemblering inte kommer att störa de funna rekombinationssignalerna, utförs ytterligare analys genom homolinearitetskontroll av närheten till genen som identifierar rekombinationshändelsen. Den synlinjära kartan med hela genomet konstruerades med hjälp av MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) för att utesluta lokala genomtranslokationer eller inversioner. Dessutom användes hela genomet för att utföra homolinearitetsanalys på aminosyrasekvensen via SyntTax webbserver (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
En mer djupgående analys av genomdatasetet som erhållits från det portugisiska multi-host tuberculosis-systemet är att kontrollera polymorfismen hos de gener som nämns i litteraturen. Dessa gener är 37, 38 och genen som kodar för 3R som erhållits av MTBC-förfäderna genom HGT-systemkomponenter (DNA-reparation, replikering och rekombination) 39. Använd ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) och använd DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) för att beräkna gendifleksivitet och nukleotiddiversitet (π) och Tajimas D-neutrala testparameterinmatning.
Ett fylogenetiskt träd med maximal sannolikhet (ML) baserat på 69 Mycoplasma bovis-isolat och referensgenom erhölls (Figur 2A). Jämfört med träd baserade på en enda gen eller träd baserade på flera lokus möjliggör denna strategi generering av kraftfullare träd som inte fångar variationen i hela genomet och därför uppvisar en lägre förmåga att skilja mellan arter 68,69. ML-trädets topologiska struktur överensstämmer vanligtvis med den komplexa klassificeringen av kloner. Genomet för Eu2 är klustrat i en gren, och genomet för Af1 är också klustrat tillsammans (Figur 2A). Resultatet överensstämmer också med det kända evolutionära förhållandet för Mycobacterium bovis, det vill säga att det finns en stor skillnad mellan Eu1-medlemmen och gruppen som består av alla andra klonala komplex och genom, men det klonala komplexet 30 är inte specificerat. Den lilla inkonsekvensen mellan det klonala komplexet och det förhållande som observerats på det fylogenetiska trädet kan förklaras av det faktum att det klonala komplexet beskrivs baserat på specifika genomiska regioner, medan det fylogenetiska trädet är baserat på multipla inriktningar av kärngenom som representerar hela genomet.
Det fylogenetiska trädet (GTR) med maximal sannolikhet konstrueras baserat på kärngenominriktningen av Mycobacterium bovis-genomet före (A) och efter (B) borttagning av rekombinationsstället. Grenfärgerna representerar Mycobacterium bovis-klonkomplexet: Europa 1 är lila, Europa 2 är röd, Europa 3 är blå, Afrika 1 är orange och Afrika 2 är grön. Trädet är rotat och ritat i skala, och grenlängden mäts som en ersättning för varje ställe.
Mycobacterium tuberculosis-komplexet beskrivs som klonalt utvecklat, och de flesta bevis som ackumulerats under åren stöder idén att pågående HGT- och rekombinationshändelser inte kommer att inträffa på den detekterbara nivån av MTBC15,17,18.
Tidigare arbete har visat att det kan finnas begränsad rekombination mellan MTBC-stammar20,21, medan andra har misslyckats med att identifiera mätbara rekombinationshändelser70,71. Diskutera denna fråga igen med fokus på Mycobacterium bovis, vilket skiljer sig från det tidigare arbetet som endast behandlade Mycobacterium tuberculosis70,71; eller betrakta MTBC som helhet, med nästan ingen M. bovis som representerar20; eller betrakta endast restriktiva nötkreatursfraktioner. Mykobakteriedatasetet, i detta arbete, innehåller totalt 70 stammar, som representerar alla klonala komplex, som används för att screena för rekombination. Datasetet är skalat enligt fyra kumulativa nivåer: (1) Eu2-medlemmar, (2) alla europeiska klonkomplexmedlemmar (dvs. Europa), (3) europeiskt och afrikanskt klonkomplex (Eu + Af) och (4) hela datasamlingen (inklusive genom som inte ingår i några kloningskomplex som redan beskrivits).
För att ytterligare studera denna hypotes utfördes ett split-decomposition-nätverk för att bedöma frånvaron av rekombinationshändelser mellan genom, eftersom denna metod kan visualisera det släktskapliga förhållandet mellan individer och visa motstridiga fylogenetiska signaler. Alla fyra datamängderna i analysen bekräftade förekomsten av loopar i nätverket (det vill säga områden som inte konvergerar till ett enda träd), men Phi-testet har inget statistiskt stöd (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; hela datamängden p = 0,2451), vilket ger dåliga bevis för förekomsten av omorganisationshändelser (Figur 3A-D).
I Europa 2 genom (n = 37) (A), europeiska genom (n = 44) (B), europeiska och afrikanska genom (n = 51) (C) och hela datamängden (n = 70) (D).
Efter denna analys, och med hänsyn till de cykliska observationerna i alla nätverk, tillämpades rekonstruktionsalgoritmen som implementerats i Gubbins pipeline för att rekonstruera den klonala härstamningen och för att komplettera uppskattningen av effekten av rekombinationen på M. bovis-genomet. Härled det kumulativa antalet rekombinationshändelser, varav de flesta inträffade i terminala grenar (det vill säga i ett enda genom) (tabell 2). Dessa indikatorer visar konsistensen i hela datamängden och indikerar att frekvensen av rekombinationshändelser är 200 till 300 gånger högre än för mutationer. När rho/theta-parametern som representerar de relativa frekvenserna av rekombination och punktmutationer på grenen verkar vara mellan 0,0037 och 0,0056 (tabell 3). Nyligen publicerade studier av 38 M. bovis-stammen visade ett högre rho/theta-värde (rho/theta = 0,1) än det som erhölls i denna datauppsättning, men Patané och kollegors arbete använde referensbaserad montering för att härleda rekombinationsparametrar. En procedurell detalj, på grund av monteringsproceduren, har associerats med överflödet av förmodade rekombinationshändelser i den terminala grenen.
Därefter representerar r/m-parametern diversitetsförhållandet mellan rekombination och mutationsintroduktion, och dess genomsnittliga värde ligger mellan 0,025 och 0,037, vilket indikerar att rekombination jämfört med mutationer har en lägre total inverkan på den genetiska mångfalden hos M. bovis (tabell 3). För omfattande jämförelse användes en liknande metod för att uppskatta r/m-parametern för MTBC-datasetet bestående av 23 genom, vilket visar ett genomsnittligt värde på 0,48620, medan det för Patané och kollegors 38 M. bovis-dataset visade sig att genomsnittsvärdet är 0,98. I den första studien inkluderades endast två av de 23 genom som inkluderades i M. bovis arbete (M. bovis BCG och referensstammen), så det erhållna värdet kan vara snedvridet på grund av överuttryck av M. tuberculosis-genomet. I den andra rapporten återfanns de analyserade Mycobacterium bovis-populationerna huvudsakligen från USA och boskapsvärdar. Däremot representeras fler geografiska platser och värdarter i vår datamängd, och genom grupperade i olika klonala komplex med olika populationsgenetiska egenskaper används också, vilket uppnår en djupare och bredare populationskunskap. Skillnaden i r/m-medelvärdet som erhålls med vår datamängd överensstämmer med konceptet att graden av rekombination varierar kraftigt mellan de linjer som tillskrivs samma taxonomiska art, så dessa resultat indikerar att M. bovis-klonkomplexet kan uppvisa rekombinationsskillnader. Effekten är också som föreslagits av Didelot & Maiden72. Att avsevärt utöka denna datamängd genom att inkludera ett större antal M. bovis-genom kommer dock att möjliggöra ytterligare förtydligande av denna punkt. Både r/m- och rho/theta-parametrarna visar variation mellan grenar, och detta resultat överensstämmer med rapporter om andra bakteriearter72,73.
Slutligen, för att bekräfta de omorganisationshändelser som identifierats av Gubbins pipeline, användes sex olika algoritmer i RDP4-programvaran för att oberoende testa olika kärnmultijämförelser. Globalt sett bekräftades mindre än hälften av de händelser som identifierades av Gubbins av RDP4 (tabell 4 och 5). Med tanke på hela datamängden bekräftades tre rekombinationshändelser, två som involverade interna noder och den andra som involverade ett enda genom i en terminal gren, för vilken klonala komplex inte kunde tilldelas (tabell 4 och 5). Identifieringen av händelser i terminala grenar kan indikera att rekombinationen fortfarande pågår i samtida M. bovis-stammar eller att resultatet är felplacerat70. I denna hypotetiska rekombinationsregion har cirka 20 % av positionerna odefinierade nukleotider (N), vilket påverkar rekombinationssignalen (kompletterande figur 2). Dessutom påverkar denna region rrs-genen, som kodar för 16S ribosomalt RNA som förväntas vara mycket konserverat, så denna förmodade rekombinationssignal kan vara resultatet av sekvenseringsfel eller feljustering. Sedan utfördes helgenomuppriktningen mellan Mb0003 och Mycobacterium bovis AF2122/97, och förekomsten av odefinierade nukleotider och SNP:er bekräftades, så de möjliga problemen relaterade till felaktig uppriktning berodde inte på den biologiska informationen som implementerades i detta arbete. Detta framkom efter att ha lärt sig programmet.
Inga luckor eller odefinierade nukleotider hittades i rekombinationsregionerna i de interna noderna (figur 4 och 5). Beträffande dessa händelser innehåller den ena endast Eu2-genomet och påverkar pks12-genen, som kodar för ett möjligt polyketidsyntas; medan den andra är registrerad i Eu1-genomet och påverkar narX-genen som kodar för ett möjligt nitratreduktas (tabell 4). I allmänhet visar rekombinationsanalysen att det finns ett begränsat antal rekombinationsfragment med statistiskt stöd, och de härledda indikatorerna indikerar att rekombinationen har en låg inverkan på M. bovis-linjen. Rekombinationssignalen förväntas vara låg, men det är viktigt att skilja den verkliga evolutionssignalen från bakgrundsbruset, vilket är en utmanande uppgift. För att minska brussignalen som introduceras av referensbaserad montering och missmatchningsproblem 70, 71, monterades alla andra utom hela genomet från grunden, och monteringskvaliteten kontrollerades och säkerställdes genom QUAST-pipelineanalys (kompletterande tabell 1). Dessutom genomfördes en serie kompletterande analyser för att säkerställa robustheten och noggrannheten i den övergripande undersökningen. Därför utvärderades sekvenseringskvaliteten för narX- och pks12-generna genom avläsningsmappning mot Mycobacterium bovis AF2122/97. Den rekommenderade SNP-positionen i rekombinationsregionen bekräftades genom att tillämpa kriterierna som nämns i metodavsnittet (minst 20 avläsningar och 0,9 förändringsfrekvenser). Polymorfismen hos narX-genen bekräftades fullständigt i de två genomerna (Mb1792361 och Mb7240415; 2,3 %) och genomerna för pks12-genomet: Mb0891-, Mb1711-, Mb1789-, Mb1870-, Mb17046-, Mb1756- och Mb12-generna. För genomet Mb2043 uppfyller dock sex av de åtta positionerna inte kriteriet för läsdjup eftersom SNP stöds av maximalt 17 läsningar, vilket är under det fastställda gränsvärdet på 20. Därför kan rekombinationen av sex genom (8,6 %) vid denna genomplats bekräftas (figur 4 och 5).
Den detaljerade visualiseringen av rekombinationsregionens inriktning i Mycobacterium bovis-datasetet påverkar narX-genen som kodar för ett möjligt nitratreduktas. Inga luckor eller odefinierade nukleotider hittades i rekombinationsregionen hos de interna noderna. Denna specifika händelse är registrerad i Eu1-genomet. Sekvenseringskvaliteten för narX-genen utvärderades genom att plotta avläsningarna av Mycobacterium bovis AF2122/97. Bekräfta den rekommenderade SNP-platsen i rekombinationsområdet genom att tillämpa kriterierna som anges i metodavsnittet (minst 20 avläsningar och 0,9 förändringsfrekvens). Polymorfismen hos narX-genen bekräftades fullständigt i genomerna Mb1792361 och Mb7240415 (2,3%).
Detaljerad visualisering av rekombinationsregionens inriktning i Mycoplasma bovis-datasetet som påverkar pks12-genen. Inga luckor eller odefinierade nukleotider hittades i rekombinationsregionen hos de interna noderna. Beträffande händelsen som påverkar pks12-genen som kodar för eventuellt polyketidsyntas, innehåller den endast Eu2-genomet. Sekvenseringskvaliteten för pks12 utvärderades genom avläsningsmappning av Mycobacterium bovis AF2122/97. Bekräfta den rekommenderade SNP-platsen i rekombinationsområdet genom att tillämpa kriterierna som anges i metodavsnittet (minst 20 avläsningar och 0,9 förändringsfrekvens). Polymorfismerna för genomerna Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 och Mb1960 har bekräftats fullständigt.
PE- och PPE-gener har repetitiva regioner som lätt kan misstolkas av Illumina-sekvensering och felmappning, så de raderas vanligtvis från bioinformatikarbetsflödet för M. tuberculosis-medlemmar endast när mappning-till-sekvens-strategin används. Inferensen av rekombinationshändelser som tillämpas i detta arbete är baserad på de novo-assemblering utan att filtrera bort PE/PPE. Vi tror att genom att implementera tre olika kompletterande metoder och algoritmer via SplitsTree, Gubbins pipeline och RDP4-programvara, är de strategier som tillämpas robusta för att bearbeta och filtrera de omorganiserade regioner som orsakas av felsignaler. För att utesluta interferens från PE/PPE-genen på Gubbins- och RDP4-programvaran för att identifiera SNP-kluster, och därmed identifieringen av de rekombinationsregioner som föreslås påverka narX- och pks12-generna, undersöktes dock dessa geners grannskap (kompletterande figur 3–5). I M. bovis AF2122/97 är narX-genen separerad av narK2 och Mb1764c, medan pks12 är omgiven av Mb2075c och Mb2073c (kompletterande figur 3-5). Kartan som genererats med hjälp av MAUVE-synlinjekartan över det kompletta genomet ger information om gensekvensbevarande och omorganisering, och visar fyra kollinjära block och inga tecken på genomtranslokation eller inversion. Dessutom bevisade komplementeringsanalysen med aminosyrasekvensen homologin i alla kompletta genom, och ingen PE/PPE hittades i de intilliggande regionerna av narX eller pks12. För narX har ett genom (Mb0030) en lägre synonympoäng eftersom narX-genen identifierades som två fragment (fragment 1891 och 1890). För pks12 uppvisade Mb0030 och Mb003 lägre synlinearitetspoäng på grund av likheter, medan pks12 identifierades i två respektive tre fragment, som representerade olika domäner av proteinet (kompletterande figur 3-5). Med hänsyn till denna information, och med Gubbins och RDP4-programvaran utförande analyser, kontrollerande av kärnans multipla inriktning av maximalt 500 bp i fönstret, bekräftade vi att PE/PPE-genen inte kommer att störa rekombinationssignalen som påverkar narX och pks12.
Även om de rekombinationssignaler som detekterats i denna datamängd kan betraktas som kvarvarande, är det sant att rekombination i M. bovis inte kan uteslutas, så den bör fortsätta att vara föremål för vidare analys, där hela genom från olika epidemiologiska scenarier sekvenseras till viktiga.
Jämförelse av de fylogenetiska träden för ML som erhölls före och efter rekombinationskorrigering (Figur 2A, B) ledde inte till signifikanta förändringar i det härledda fylogenetiska sambandet, och M. bovis-stammarna klustrades i samma grupp.
Efter att ha kartlagt 42 nysekvenserade M. bovis-avläsningar med referensgenomet för M. bovis AF2122/97 erhölls en SNP-inriktning innehållande 1816 polymorfa positioner. De flesta SNP:er (87,1 %) är belägna i den kodande regionen, och de drabbade generna karakteriseras enligt de funktionella kategorier som visas i Bovilist (Figur 6A, B). Med hänsyn till det totala antalet gener i varje funktionell kategori uppvisade generna i kategorin "lipidmetabolism" fler SNP:er, följt av "cellvägg och cellprocesser" och "mellanliggande metabolism och respiration", vilket avslöjar att de befinner sig i M. bovis-evolutionen.
Hierarkisk analys av M. bovis-datasetet från Portugal (n = 42). Det totala antalet registrerade SNP:er och påverkade gener för varje funktionell kategori (A). Det totala antalet synonyma och icke-synonyma förändringar registrerade per funktionskategori (B).
På global skala är det genomsnittliga dN/dS-förhållandet bättre än 1,5, vilket indikerar att det globala evolutionära trycket är att bli av med det ursprungliga tillståndet och representerar ett positivt (diversifierat eller riktat) och/eller avslappnat reningsvalsscenario. I kategorierna "virulens, avgiftning, anpassning", "insertionssekvenser och fager" och "reglerande proteiner" är mer än två tredjedelar av SNP:erna icke-synonyma (Figur 6B).
I alla kategorier finns gener med flera SNP:er, vilket resulterar i en genomsnittlig mutationsfrekvens (det vill säga den genomsnittliga SNP:n per gen) större än 1 (Figur 6A). Pks12 (Mb2074c) med 15 SNP:er och fas (Mb2553c) med 8 SNP:er har högre mutationsvärden. Båda dessa gener är involverade i fettsyrametabolismen. pks-genen kodar för polyketidsyntas (PKS), vilket är ett multifunktionellt enzym involverat i lipidbiosyntesen i mykobakteriers cellväggar74,75. Denna gen kodar för en multifunktionell polypeptid som är involverad i syntesen av mykoketider74,76. fas-genen är involverad i syntesen av mykolsyra. Båda dessa gener spelar en viktig roll i biosyntesen av cellväggen i kontakt med värden.
För att ytterligare studera utvecklingen av Mycobacterium bovis analyserades två uppsättningar specifika gener. Tidigare publicerade arbeten med sekvenskomposition och fylogenetiska metoder identifierade gener som förvärvats av MTBC-förfäder genom HGT före diversifiering37,38. Dessa gener listas i tilläggstabell 2. SNP-fördelningen för totalt 77 gener som kan vara relaterade till HGT analyserades, och 26 polymorfa platser identifierades, vilket i de flesta fall (78%) resulterade i icke-synonyma (NS) förändringar (tilläggstabell 2). Tidigare arbete med MTBC-genomet visade att den förmodade HGT-regionen uppvisar ett högre NS SNP-förhållande jämfört med resten av genomet. Om man tror att dessa rekombinationsregioner förvärvades av MTBC-förfäder, och därför överrepresenterar forntida polymorfismer, förväntas andelen synonyma förändringar vara högre, eftersom NS-substitutioner förväntas elimineras genom negativ selektion på grund av att aminosyraförändringar kan förändra proteinets funktion. Därför indikerar våra resultat att de funktionella konsekvenserna kan härröra från ersättningen av HGT-liknande gener, vilket återspeglar deras betydelse för värdefull adaptiv genetisk mångfald.
Parallellt med denna analys undersöktes generna som kodar för komponenterna i 3R-systemet (DNA-reparation, replikering och rekombination) noggrant i enlighet med den lista som tidigare publicerats av dos Vultos och medarbetare (2008)39. Utbytet av identiska DNA-fragment kan inte observeras direkt, även om det kan vara en frekvent process när närbesläktade bakterier är involverade, såsom i fallet med denna datamängd; dessutom kan denna process vara nyckeln till DNA-reparationsmetoder72, så de spelar en roll i homolog rekombination. Totalt 26 polymorfa positioner fördelade på 54 gener identifierades (kompletterande tabell 3). I denna uppsättning gener stod NS-förändringar för cirka 65 % av konsekvenserna, vilket överensstämmer med tidigare rapporter om Mycobacterium tuberculosis-stammar.
Publiceringstid: 21 oktober 2021