Gratias tibi ago quod "Naturam" invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem pro CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut recentiorem versionem navigatri utaris (aut modum compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Simul, ut continua sustentatio praestetur, situs sine stylis et JavaScript demonstrabimus.
Sequentiatio genomi campum investigationis morborum infectiosorum revitalizat, epidemiologiam morborum, pathogenesin, interactiones inter hospitem et pathogenum, et processum evolutionarium pathogenis impositum revelans. Complexus Mycobacterium tuberculosis (MTBC) Mycobacterium bovis ut unum ex membris suis adaptivis animalibus quae tuberculosin (TB) in mammalibus terrestribus causant considerat, et exemplar typicum evolutionis bacterialis est. Sicut alia membra MTBC, Mycobacterium bovis pathogenum stricte clonatum, lente evolvens esse putatur, et nullum signum recombinationis vel translationis genorum horizontalis est manifeste. In hoc opere, genomicam comparativam ad collectionem datorum sequentiae totius genomi (WGS) ex 70 M. boum ex diversis genealogiis (Europa et Africa) compositum applicamus ut perspicientiam in diversitatem geneticam M. boum adipiscamur. Vis evolutionaria. Tres methodi diversae adhibentur ad signa reorganizationis aestimanda. Globaliter, numerus parvus eventuum recombinationis identificatus et confirmatus est duabus methodis independentibus cum solido supporto. Nihilominus, comparata cum mutationibus, recombinatio effectum debiliorem in diversitatem *M. bovis* habet (summa r/m = 0.037). Differentia r/m media obtenta in complexo clonali *M. bovis* in nostro indice datorum congruit cum notione generali gradum recombinationis inter stirpes eidem speciei taxonomicae assignatas magnopere variare posse. Secundum hoc opus, recombinatio in *M. bovis* excludi non potest, ergo materia ulteriorium conatuum in futuris investigationibus genomicis comparativis esse debet, in quibus analysis graduum (WGS) magnorum indicerum datorum ex diversis scenariis epidemiologicis toto orbe terrarum crucialis est. Deinde analysis addita in minore indice datorum *M. bovis* (n = 42) ex praevalentia TB multi-hospitis peracta est, et plus quam 1800 loci identificati sunt, quorum saltem una stirps polymorphismum nucleotidi singularis (SNP) ostendit. Pleraque (87.1%) in regione codificante sita sunt, et proportio globalis mutationum non-synonymarum (dN/dS) mutationum synonymarum 1.5 excedit, quod indicat selectionem positivam vim evolutionariam magni momenti in M. bovis exercitam esse. Maior proportio SNP detecta est in genis divitibus categoriis functionalibus "metabolismo lipidorum", "processuum parietis cellularis et cellularum", et "metabolismo intermedio et respiratione", quod potentiam eorum in biologia et evolutione momenti Mycobacterium bovis revelat. Inspectio accuratior genorum in maioribus MTBC quae translationi genorum horizontali prona sunt et in systemate 3R (reparatione, replicatione et recombinatione DNA) inclusa sunt valorem negativum medium globalem probationis D neutrae Taijimae revelat, quae perscrutationem selectivam praeteritam indicat. Recens angustia post expansionem populationis adhuc est praecipuus factor evolutionarius impulsivus pro pathogeno necessario Mycobacterium bovis ad pugnandum contra hospitem.
Complexus Mycobacterium tuberculosis (MTBC) est unus e taxonibus pathogenorum bacterialium felicissimis et exemplum typicum evolutionis bacterialis. Eius membra identitatem nucleotidorum in gradu genomico mirum in modum magnam (> 99%) ostendunt1,2. Diversi oecotypi MTBC tuberculosis (TB), quae est morbus granulomatosus infectiosus, in ampla varietate specierum hospitum, a micromammalibus ad homines3,4,5, causare possunt. Hodie, complexus homines [M. tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] et pathogena animalibus adaptata (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" et "dassie")5,6 comprehendit. *M. canettii* (etiam "Nodobacter glabrata" appellatum) Identitas nucleotidorum media cum mycobacteriis supradictis est 98%, et opera genomica comparativa demonstraverunt *M. canettii* et reliquum MTBC nuper a communi progenitore divergere.7 Hoc conceptu considerato, quidam auctores *M. canettii* "Sodalem MTBC 8" appellant.
MTBC systematice describitur ut complexus clonalis strictus, cuius structura populationis clare regitur diversitate reducta, angustiae, perscrutatione selectiva, et deriva genetica9,10. Supponendo evolutionem clonalem strictam complexam, ut polymorphismi absentes, non posse restitui per recombinationem. Hac praemissa innixa, eventa consecutiva deletionis genomicae regionis differentialis (RD) et TbD1 (regionis deletionis specificae Mtb 1) propositi sunt ut indices moleculares evolutionis MTBC2,5,11. Opus genomicae comparativae et sequentiationis totius genomi (WGS) divisionem membrorum humanitus adaptatorum in novem stirpes (Mycobacterium tuberculosis L1 ad L4, L7, et L8; et Mycobacterium africanum L5, L6, et L9) sustinet, stirpes L2 ad L4 deletionem regionis TbD1 communicaverunt2,11,12,13. Praeterea, membra ad animalia adaptata proponuntur communem progenitorem habere, qui deletionibus clado-specificis in RD7, RD8, RD9 et RD102, 5, et 14 definitur.
Translatio genorum horizontalis (HGT) et eventus recombinationis rari habentur et in maioribus MTBC occurrunt, potius quam in historia diversa totius membri MTBC15,16,17. Duo relationes priores a Hughes et collaboratoribus (2002) et Gutacker et collaboratoribus (2006) factae suggesserunt eventus recombinationis adiuvare posse ad formandum polymorphismum qui locos specificos in stirpibus M. tuberculosis designant18,19. Causae manifestae defectus recombinationis in MTBC sunt: (1) processus mechanicus et amissio facultatis HGT; (2) raritas eventuum HGT; (3) nulla est possibilitas eventuum recombinationis in foro MTBC14,17. Nuper, quaedam studia sequentiationis totius genomi (WGS) ad stirpem MTBC 20 et Mycobacterium bovis 21 applicata indicia recombinationis praebuerunt, prima quae ostendit stirpes MTBC saepe parva fragmenta DNA permutare, sed propter limitatam variationem sequentiae nucleotidorum, hi eventus adhuc non animadvertuntur.
*Mycobacterium bovis* est membrum MTBC frequentissime recuperatum e pecoribus (praesertim bobus), quamquam etiam ex animalibus liberis et saeptis feris segregari potest4,22,23,24. *M. bovis* in quinque complexus clonales maiores [Europaeus 1 (Eu1), Europaeus 2 (Eu2), Europaeus 3 (Eu3), Africanus 1 (Af1) et Africa 2 (Af2)] evolutus est, secundum spoligotyping profile, deletiones specificas et polymorphismos nucleotidi singularis (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 in genis specificis. Hi complexus clonales structuram diversam populationis *Mycobacterium bovis* et eius associationem cum regionibus geographicis demonstrant. Praeterea, recens opus WGS a Zimpel et collaboratoribus (2020) perfectum phylogenesin in SNP Mycobacterium bovis fundatam, cum plus quam 1900 genomis, designavit, indicans saltem quattuor stirpes diversas (nominatas Lb1 ad Lb1 ad Lb4) exstare, quae non plene congruunt cum complexo clonali antea definito, quamquam specificitas geographica etiam confirmari potest30. Hi auctores analysin differentialem phylogenesin et datationem molecularem perfecerunt, sed recombinationem non studiaverunt30.
Opera priora, variis technis molecularibus utens, velut spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), et recenti typing SNP, certum diversitatis geneticae gradum inter stirpes *M. bovis* revelaverunt [31, 32, 33, 34, 35]. Differentiatio variationis geneticae instrumentum magni momenti in studio epidemiologiae morborum facta est, quod utile est ad profundam comprehensionem pathogenesis, virulentiae et transmissionis morborum. Emergentia methodi WGS possibilitatem praebet ad factores evolutionarii impulsivos a genoma Mycobacterium bovis impositos in processu adaptationis et persistentiae ad varios hospites et scenaria epidemiologica revelandos.
In hoc opere, analysi genomica comparativa variorum Mycoplasmatis bovis collectionum datorum (n=70), inclusis isolatis ex diversis complexibus clonalibus, utimur ad perspiciendum processum evolutionarium Mycoplasmatis bovis, praesertim ad resolvendas relationes phylogeneticas et eventus recombinationis. Supplemento huius analysis, sub-collectio datorum isolatorum M. bovis (n=42) ex area bene characterizata multi-hospitis tuberculosis in Lusitania 31,36 obtenta ulterius explorata est ad inferendam non-identitatem. Aequilibrium inter rationem relativam substitutionum nucleotidorum sensuum (dN) ad synonyma (dS), necnon contributionem evolutionariam genomatum specificorum in litteris commemoratorum, quae 37,38 a maioribus MTBC per HGT obtenta sunt, et componentes genorum systematis 3R (reparationis, replicationis, et recombinationis DNA) codificant 39. Gena per HGT obtenta eligimus quia polymorphismos antiquos repraesentare possunt, ita expectatur ut maiorem proportionem mutationum synonymarum contineant. Gena in systemate 3R inclusa selecta sunt quia opera priora de stirpibus *M. tuberculosis* selectiones generales negativas/purificationis indicaverunt quae in his genis operantur, et hae stirpes partes magnas in evolutione agere possunt 39. Aliud propositum huius operis est existentiam eventuum reorganizationis concludere. Quapropter, cum nostra dataset ex Lusitania tantum genoma complexus clonalis Europaei 2 et stirpes quibus complexum clonale non assignatum est contineat, decrevimus data genomatica publice praesto includere ut tandem repraesentativum omnium complexuum clonalium obtineamus, et firmitatem atque amplitudinem resultatorum augeamus.
Quadraginta duo genoma Mycoplasmatis bovis nuper sequentiata ex scaena tuberculosis multi-hospitis endemica Lusitana (singula infra), antea ex prospectu epidemiologico descripta36, centrum huius operis constituunt. Cum copia datorum ex Lusitania tantum repraesentativa complexuum clonorum Europaeorum duorum et stirpium sine complexibus designatis habeat, data sequentiationis totius genomatis publice praesto addita sunt ad copiam datorum quae omnia repraesentativa complexuum clonorum M. bovis includit amplificandam. Quapropter, tres fontes datorum sequentiationis totius genomatis in hoc opere adhibiti sunt: aggregatio genomatis completa/adumbrata, usque ad decem scaffolds in NCBI (Centro Nationali Informationis Biotechnologicae) reposita (n = 15 isolata); in SRA reposita (fasciculus Illumina fastq archivi lectionis sequentiae) diversitatem complexam clonorum M. bovis repraesentat (n = 12 isolata)30; et quadraginta duo genoma nuper sequentiata ex Lusitania. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ex inquisitione NCBI exclusus est. *M. bovis AF2122/97* plerumque ut genoma referentiale in collectione datorum includitur. Propter publicam indisponibilitatem totius sequentiae genomae, quam complexus clonationis African 1 repraesentat, et parvum numerum genomatum ex stirpibus repraesentativis Af2 et Eu1, data sequentiationis originalis a SRA provisa his casibus adhibita sunt. Opus Zimpel et collaboratorum eius (2020) adiuvit ad identificandum genoma ex complexu clonationis supradicto et adiuvit ad eligendum *Mycobacterium bovis* ad inclusionem in collectione datorum. Pro *Eu3*, unum tantum genus genomae describitur (Branger et al., 2020), ergo genoma quod includimus est repraesentativum separatum complexus Eu3.
Globaliter, haec notitiarum copia septuaginta boves *M. bovis* ex octo speciebus hospitibus isolatos comprehendit, in duodecim terris ab anno 1985 ad annum 2016 distributos. Triginta sex species ut Eu2 designantur, septem species Eu1, una species Eu3, tres species Af1, quattuor species Af2, et undeviginti nulli complexu clonali attribui possunt (vide infra). Informationes singulares (numero accessionis incluso) de *Mycobacterium bovis* in hoc studio adhibitae in Tabula 1 et Tabula Supplementi 1 monstrantur.
Quadraginta duo genoma integra Mycobacterium bovis nuper sequentiata, ex locis calidis tuberculosis animalium Lusitaniae et per plus quam duodecim annos distributa, centrum huius studii constituunt, cum systemata morborum potentialia inter animalia fera et pecora regulariter observata sint 31,36 (Figura Suppletoria 1). Secundum rationes subsequentes, hae stirpes e bobus (n = 14), cervis rubris (n = 16) et apro (n = 12) ab anno 2003 ad 2015 isolatae sunt: animalia secundum normas protocolli commendatas collige et tracta. Exempla textuum in Enchiridion Animalium Terrestrium OIE inveniuntur et in medio solido pyruvati Stonebrink et Löwenstein-Jensen et medio liquido inoculantur. Culturae ad 37°C incubantur et incrementum semel in hebdomada per saltem duodecim hebdomadas probatur. Coloniae directe in solutione glycerini ad -80ºC servantur. In medio selectivo Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), exempla originalia archivata per singulum transitum *in vitro* transmissa sunt ad DNA programmatis WGS obtinendum. Ad hoc, solutio congelata culturae locupletata est cum 5% natrii pyruvato et 10% ADS (50 g albumini, 20 g glucosii, 8.5 g natrii chloridi in 1 L aquae) in Middlebrook 7H9 ad 37°C Retrain. Post 4 septimanas accretionis, medium renovatum est et cultura regulariter monitorata est donec accretio observata est. Cellulae centrifugatione collectae sunt, pellet resuspensum est in 500 µL solutione salina phosphato tamponata (PBS), calefactum ad 99°C per 30 minuta, centrifugatum, et supernatans ad -20°C conservatum est usque ad WGS. Omnes rationes in facilitatibus biosalutis gradus 3 peraguntur.
Bibliotheca genomi paria-terminorum WGS paratur utens indice singulari cuiusque exempli DNA, et technologiam Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 exempla) et HiSeq (2 × 150 pb) (duo isolata) (Eurofins Genomics, Germania) ad sequendum adhibet. Secundum instructiones fabricatoris, Illumina Genome Analyzer cum modulo utrinque-termino ad sequendum DNA genomicum utere, et Nextera XT DNA Library Prep Kit ab Illumina ad bibliothecam construendam utere.
Consideratis datis ex SRA recuperatis (n = 12), identificatio complexus clonalis adhiberi potest ut metadata publicationis correspondentis 30, 41, 43. Cum genoma completum consideratur, excepto Mycobacterium bovis AF2122/97 et Mycobacterium bovis 3601, quae membra agnita complexus clonalis Eu1 et Eu3 25, 29 respective sunt, idem est ac genoma completum Mycobacterium tuberculosis H37Rv (numerus accessionis NCBI NC_000962.3). Aequatio genomatis perficitur utens MAFFT (programma aequationis multiplicis aminoacidorum vel sequentiae nucleotidorum, versio 7.458) et parametro -addfragments48. Deinde, absentia complexuum clonalium diversorum et/vel praesentia proprietatum SNP quaeritur.
Mycobacterium bovis nuper sequentiatum (n = 42) et lectiones originales exemplaris genomatis compositi (n = 3) complexum cum genoma referentiali Mycobacterium tuberculosis H37Rv per canalem vSNP et praesentiam deletionis et/vel proprietatum SNP clonorum diversorum coniungunt. Investigatio peracta est.
Informationes ex absentia proprietatum et/vel praesentia/absentia SNP et profilorum spoligotypationis collige ut notitias genomicas complexo clonali correspondenti assignes. Pro quattuor exemplaribus coetuum, profilum spoligotypationis inferri non potest, itaque in grege "nullae complexitatis" includuntur.
Processus bioinformatici huius operis incipit ab aggregatione *de novo* et mappatione ad strategiam referentialem, eo consilio ut eventus recombinationis et polymorphismos genomi specificos explorentur. Figura 1 schema fluxus graduum sequendorum praebet. Ad analysin recombinationis, omnia genoma adhibentur ad augendam firmitatem deductionum et indicatorum conexorum.
Ut errores in generatione sequentiarum consensuum genomicorum minuerentur, primum aggregationem *de novo* (de novo) consecuti sumus, deinde alignationes multiplices centrales (core multiplex) consecuti sumus. Canalis Unicycler nunc apud https://github.com/rrwick/Unicycler49 praesto est et ad aggregationem *de novo* 54 genomatum sequentiatorum perficiendam adhibetur (42 nuper sequentiata et 12 fasciculi *fastq* ex SRA recuperati). Breviter, antequam aggregationem ex nihilo factam est, analysis qualitatis lectionis in FastQC versione 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) et Trimmomatic versione 0.36 (optionibus "secans Adaptores et alias sequentias illuminationi specificas ex lectionibus" et "Secans bases ex fine lectionis, si inferior quam limen qualitatis 20" applicatis) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic)50 peracta est. Deinde, SPAdes optimiser49 ad aggregationem genomicorum adhibitus est, et Pilon versio 1.1851 ad optimizationem post-aggregationem adhibita est. Modus pontis conservativus electus est ad vitandam incorrectam compositionem, et magnitudo k-mer inter 20% et 95% longitudinis lectionis investigata et selecta est. Sequere normas SPAdes et considera magnitudinem lectionis, dele contigas minores quam 300 bp, et constitue limen operimenti profunditatis lectionis 20 ad 52. In strategia compositionis *de novo*, regiones genomicae, ut paralogi prolini-glutamati (PE) et prolini-prolini glutamati (PPE), valde repetitivi, non remoti sunt.
Qualitas coacervationis *de novo* per canalem QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html) aestimatur, qui renovationem contig et mappationem genomi referentialis *M. bovis AF2122/97* (numerus accessionis NCBI LT708304.1) facilitat (vide Tabulam Supplementarem 1 pro parametris qualitatis).
Auxilio canalis vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), fasciculus FASTQ M. bovis nuper sequentiati ex Illumina sequentiatione comparatur cum genoma referentiali M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Secundum optimas commendationes Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, parametri filtri normae vel variantium massarum indices ad recalibrationem adhibentur. Resultata filtrantur utens minimo indice massae SAMtools 150 et AC = 2. Etiam Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) adhibetur ad lectiones inspiciendas et contaminationem excludendam. Canalis vSNP adhibitus ad sequentias strategias mappandas in nostro opere seriem SNP definitorum et scoporum examinat, et etiam scenaria infectionis mixtae excludit. Operimentum genomi lectitatis melior est quam 99% (Tabula Supplementaria 1).
Ad vitandos errores in mappatione et SNP falsos, variantem exclude in sequentibus casibus: (1) minus quam viginti lectionibus sustentatur, (2) frequentia minor quam 0.9 invenitur, (3) in saltem uno stirpe est, sed saltem hiatus in alio stirpe sunt. Instrumentum integratum ad genomica spectanda (IGV) versione 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 adhibitum est ad SNP et positiones cum problematibus mappationis vel alignationis visualiter verificandas. Cum gena prolini-glutamati (PE) et prolini-prolini glutamati (PPE) valde duplicata sint et partem familiae multi-genicae sint, facile a sequentiatione Illumina et errore mappationis male intelleguntur, ita praeferuntur. Fluxus operis bioinformaticae mycobacterialis membra complexus tuberculosis removit cum strategia mappationis ad sequentiam ad confirmandos SNP adhibebatur. Ideo, gena PE/PPE et indeles ab analysi exclusimus.
Secundum Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), omnes SNPs in categorias functionales dividuntur. Canalis SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) ad consequentias SNP (mutationes synonymas vel non-synonymas) inferendas adhibetur. Nova basis datorum genomi Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1) creata est.
Ordinatio multiplix genomi centralis peracta est utens Parsnp v1.2, quod nunc apud https://github.com/marbl/parsnp57 praesto est, utens 69 genomis completis/copulationibus exemplaribus (cum optione -c) et *M. bovis* AF2122/97 (LT708304.1) ut exemplar adhibitum est. Quattuor ordinationes multiplices centrales peractae sunt: solum membra complexus clonationis Eu2 (n = 37), includentia omnia membra complexus clonationis Europaei (n = 44), includens punctum iunctionis complexus clonationis Europaei et Africani (n = 51), et includentia omne *Mycobacterium bovis* in hoc studio (n = 70).
Ordinatio principalis a Parsnp generata ad arborem phylogeneticam maximae verisimilitudinis (ML) inferendam utens CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 utens RAxML adhibetur, et ad mille replicationes directas peragendas.
Tres diversi algorithmi et instrumenta bioinformatica adhibentur ad praesentiam eventuum recombinationis parallelarum explorandam: programmata SplitsTree4, canalis Gubbins (propagatio sine praejudicio per recombinationem in sequentiis nucleotidorum), et programmata RDP4 (programma detectionis recombinationis, versio beta 4.101).
Methodus decompositionis divisae, in SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 adhibita, ad reticulum phylogeneticum sine radicibus calculandum adhibetur, probatione Phi ad verificationem statisticam utens, et limen significationis p = 0.05 est. Analysis multi-alignment principalis Parsnp ut input adhibetur, et decompositio divisa ut norma retialis perficitur.
Canalis Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) cum parametris praedefinitis currit ut alia via ad aestimandum impulsum recombinationis in Mycobacterium bovis. Algorithmus in canali implementatus stirpem clonorum pertinentem reconstruit. Completum genoma/adumbratio aggregationis nostrae copiae datorum et genoma referentialis (bovinum bovidum AF2122/97, LT708304.1) inter se concordant; et positionem SNP in utroque ramo arboris perscrutatur ad detegendum gregem SNP eventum recombinationis repraesentantem. Zero rami. Assume nullum eventum recombinationis esse, quod significat SNP quae in ramo occurrunt aequaliter distribui debere. Alignamentum multiplex centrale ex Parsnp et arbor ML optime punctata ex RAxML ut fasciculi inputati adhibentur.
Denique, ut eventus reorganizationis a Gubbins pipeline suggestus confirmetur, sex algorithmi in RDP467 implementati (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 et SiScan66) ad ordinationem multiplicem principalem Parsnp sub optionibus implicitis adhibentur. Determinavimus saltem tres algorithmorum in RDP4 implementatorum constanter signum grave demonstrare debere ad unumquemque eventum recombinationis verificandum.
Cum et programmata Gubbins et RDP signa recombinationis quaerant per inspectionem multiplicium alignationum principalium in fenestra usque ad 500 bp, et confirmando inclusionem genorum PE/PPE per congregationem *de novo* signis recombinationis inventis non impedituram esse, analysis ulterius fit per homolinearitatem, vicinitatem geni eventum recombinationis identificantis inspiciendo. Tabula synlinearis, genoma completo utens, constructa est utens MAUVE-multi-genome alignatione (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ad translocationes locales genomae vel inversiones excludendas. Praeterea, totum genoma adhibitum est ad analysin homolinearitatis in sequentia aminoacidorum per servitorem interretialem SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) peragendam.
Analysis profundior copiae notitiarum genomicarum ex systemate Lusitano multi-hospitis tuberculosis obtentae est ad polymorphismum genorum in litteris memoratorum examinandum. Haec gena sunt 37, 38 et gen 3R codificans a maioribus MTBC per componentes systematis HGT (reparationis, replicationis et recombinationis DNA) 39 obtentum. Ad diversitatem genorum et diversitatem nucleotidorum (π) et parametrum probationis D neutrum Tajimae computandum, ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) et DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) adhibe.
Arbor phylogenetica maximae probabilitatis (ML) in 69 isolatis Mycoplasmatis bovis et genomis referentialibus obtenta est (Figura 2A). Comparata cum arboribus unius geni vel multilocis fundatis, haec strategia generationem arborum potentiorum permittit quae variabilitatem totius genomi non capiunt et ideo minorem facultatem discriminandi inter species exhibent 68,69. Structura topologica arboris ML plerumque congruit cum classificatione complexa clonorum. Genomum Eu2 in ramo congregatur, et genomum Af1 etiam simul congregatur (Figura 2A). Resultatum etiam congruit cum nota relatione evolutionaria Mycobacterium bovis, id est, magna differentia est inter membrum Eu1 et gregem constantem ex omnibus aliis complexibus et genomis clonalibus, sed complexus clonalis 30 non specificatur. Parva discrepantia inter complexum clonalem et relationem in arbore phylogenetica observatam explicari potest eo quod complexus clonalis describitur secundum regiones genomicas specificas, dum arbor phylogenetica in multis alignationibus genomatum principalium totum genoma repraesentantibus fundatur.
Arbor phylogenetica maximae probabilitatis (RTP) construitur secundum ordinationem genomi centralis Mycobacterium bovis ante (A) et post (B) remotionem loci recombinationis. Colores ramorum complexum cloni Mycobacterium bovis repraesentant: Europa 1 purpurea est, Europa 2 rubra est, Europa 3 caerulea est, Africa 1 aurantiaca est, et Africa 2 viridis est. Arbor radicata est et ad scalam delineata, et longitudo rami mensuratur ut substitutio pro quolibet loco.
Complexus Mycobacterium tuberculosis quasi clonaliter evolutus describitur, et pleraque testimonia per annos accumulata notionem confirmant continuationem HGT et eventus recombinationis non eventuros esse ad gradum detectabilem MTBC15,17,18.
Opera priora demonstraverunt recombinationem limitatam inter stirpes MTBC fortasse exstare20,21, dum alia eventus recombinationis mensurabiles identificare nequiverunt70,71. Hanc rem iterum discute cum attentione ad Mycobacterium bovis, quod differt ab opere priore quod solum Mycobacterium tuberculosis consideravit70,71; vel considera MTBC ut totum, cum fere nullo M. bovis repraesentante 20; vel tantum fractiones restrictivas boum considera. In hoc opere, in summa, sunt 70 stirpes, omnes complexus clonales repraesentantes, ad recombinationem investigandam adhibitae. Series datorum secundum quattuor gradus cumulativos dividitur: (1) membra Eu2, (2) omnia membra complexus clonalis Europaei (i.e. Europa), (3) complexus clonalis Europaeus et Africanus (Eu + Af) et (4) tota Collectiones datorum (inclusa genoma quae non includuntur in ullis complexibus clonalis iam descriptis).
Ad hanc hypothesin ulterius investigandam, reticulum decompositionis divisae (split-decomposition network) ad absentiam eventuum recombinationis inter genoma aestimandam peractum est, quia haec methodus relationem ancestralem inter individua visualizare et signa phylogenetica conflictantia demonstrare potest. Omnes quattuor collectiones datorum in analysi existentiam ansarum (loops) in reticulo confirmaverunt (hoc est, areas quae in arborem unicam non convergunt), sed probatio Phi nullum firmamentum statisticum habet (Eu2, p = 0.0956; Europa, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; tota collectio datorum p = 0.2451), quod probationem pauperem pro existentia eventuum reorganizationis praebet (Figura 3A-D).
In Europa duo genomata (n = 37) (A), genomata Europaea (n = 44) (B), genomata Europaea et Africana (n = 51) (C) et totus congeries datorum (n = 70) (D).
Post hanc analysin, et observationibus cyclicis in omnibus retibus consideratis, algorithmus reconstructionis in canali Gubbins implementatus adhibitus est ad stirpem clonalem reconstruendam et ad aestimationem effectus recombinationis in genoma M. bovis supplendam. Numerum cumulativum eventuum recombinationis inferre, quorum pleraque in ramis terminalibus (hoc est, in uno genoma) evenerunt (Tabula 2). Hi indices constantiam totius copiae datorum ostendunt et indicant frequentiam eventuum recombinationis 200 ad 300 vicibus maiorem esse quam mutationum. Cum parametrus rho/theta, qui relativas rates recombinationis et mutationum punctualium in ramo repraesentat, inter 0.0037 et 0.0056 esse videatur (Tabula 3). Nuper, opus divulgatum de stirpe 38 *M. bovis* valorem rho/theta maiorem (rho/theta = 0.1) quam qui in hoc indice obtentus est demonstravit, sed opus Patané et sociorum compositionem secundum referentias ad parametros recombinationis inferendos adhibuit. Detalium procedurale, propter processum compositionis, cum abundantia eventuum recombinationis putativorum in ramo terminali coniunctum est.
Deinde, parametrus r/m rationem diversitatis recombinationis et introductionis mutationis repraesentat, et eius valor medius inter 0.025 et 0.037 est, quod indicat recombinationem, comparatam cum mutationibus, minorem effectum generalem in diversitatem geneticam M. bovis habere (Tabula 3). Ad comparationem amplam, similis methodus adhibita est ad parametrum r/m aestimandum pro indice MTBC composito ex 23 genomis, valorem medium 0.48620 ostendens, dum pro indice Patané et collegarum 38 M. bovis, valor medius 0.98 esse probatus est. In primo studio, tantum duo ex 23 genomis in opere M. bovis inclusis (M. bovis BCG et stirps referentialis), ergo valor obtentus fortasse praeiudicatus est propter superexpressionem genomi M. tuberculosis. In secundo relatu, populationes Mycobacterium bovis analysatae plerumque ex Civitatibus Foederatis Americae et hospitibus pecorum recuperatae sunt. Contra, in nostro datorum grege, plura loca geographica et species hospites repraesentantur, et genoma in diversa complexa clonalia cum diversis notis geneticis populationis congregata etiam adhibentur, ita cognitionem populationis altiorem et latiorem assequendo. Differentia valor medii r/m cum nostro datorum grege obtenta congruit cum notione gradum recombinationis inter stirpes eidem speciei taxonomicae assignatas magnopere variare, ita haec eventa indicant complexum clonalem M. bovis differentias recombinationis exhibere posse. Impactus etiam est sicut a Didelot & Maiden suggessum est72. Nihilominus, hoc datorum gregem significanter amplificando per maiorem numerum genomatum M. bovis includendum, ulteriorem clarificationem huius puncti permittet. Tam parametri r/m quam rho/theta variabilitatem inter ramos ostendunt, et hoc eventum congruit cum relationibus de aliis speciebus bacterialibus72,73.
Denique, ad confirmanda eventa reorganizationis a Gubbins pipeline identificata, sex algorithmi diversi in programmate RDP4 adhibiti sunt ad varias comparationes multiplices independenter probandas. Globaliter, minus quam dimidium eventuum a Gubbins identificatorum ab RDP4 confirmatum est (Tabulae 4 et 5). Toto datorum indice considerato, tria eventa recombinationis confirmata sunt, duo nodos internos implicantes et alter unum genomum in ramo terminali implicans, pro quo complexus clonales assignari non potuerunt (Tabulae 4 et 5). Identificatio eventuum in ramis terminalibus indicare potest recombinationem adhuc in progressu esse in stirpibus contemporaneis M. bovis vel eventum male collocatum esse70. In hac regione hypothetica recombinationis, circiter 20% positionum nucleotida (N) indefinita habent, ita signum recombinationis afficientes (Figura Supplementaria 2). Praeterea, haec regio gen rrs afficit, RNA ribosomalem 16S codificans quod valde conservatum esse expectatur, ita hoc signum recombinationis putativum ex erroribus sequentiationis vel malalignamento oriri potest. Deinde totius genomi ordinatio inter Mb0003 et Mycobacterium bovis AF2122/97 peracta est, et existentia nucleotidorum et SNP indefinitorum confirmata est, ergo problemata possibilia cum ordinatione erronea orta non ex informatione biologica in hoc opere implementata oriri coeperunt. Post programmatis cognitionem apparuerunt.
Nullae lacunae aut nucleotida indefinita in regionibus recombinationis nodorum internorum inventa sunt (Figurae 4 et 5). De his eventibus, unum solum genomum Eu2 continet et genum pks12 afficit, quod possibilem polyketidum synthasem codificat; alterum autem in genoma Eu1 inscriptum est et genum narX afficit, quod possibilem nitratis reductasim codificat (Tabula 4). In genere, analysis recombinationis ostendit numerum limitatum fragmentorum recombinationis cum supporto statistico esse, et indices coniecturales indicant recombinationem parvum impulsum in stirpem M. bovis habere. Signum recombinationis parvum exspectatur, sed interest verum signum evolutionis a strepitu circumstanti distinguere, quod negotium difficile est. Ut signum strepitus a problematibus compositionis et discrepantiae secundum referentias 70, 71 inductum reduceretur, omnia reliqua praeter genomum completum ex nihilo assemblata sunt, et qualitas assemblationis per analysin ductus QUAST verificata et confirmata est (Tabula Supplementaria 1). Praeterea, series analysium supplementariarum peracta est ad firmitatem et accuratiam totius investigationis confirmandam. Quapropter, qualitas sequentiationis genorum narX et pks12 per mappationem lectionis contra Mycobacterium bovis AF2122/97 aestimata est. Positio SNP commendata in regione recombinationis confirmata est applicando criteria in sectione methodi memorata (saltem 20 lectiones et frequentia mutationis 0.9). Polymorphismus geni narX plene confirmatus est in duobus genomis (Mb1792361 et Mb7240415; 2.3%) et genomis genomi pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, et Mb12. Attamen, pro genoma Mb2043, sex ex octo positionibus criterium profunditatis lectionis non implent, quia SNP a maximo 17 lectionum sustentatur, quod infra valorem liminis constitutum 20 est. Ergo, recombinatio sex genomatum (8.6%) in hoc loco genomatis confirmari potest (Figurae 4 et 5).
Visualizatio accurata dispositionis regionis recombinationis in collectione datorum Mycobacterium bovis genum narX afficit, quod possibilem nitrate reductase codificat. Nullae lacunae aut nucleotida indefinita in regione recombinationis nodorum internorum inventa sunt. Hoc eventum particulare in genoma Eu1 registratur. Qualitas sequentiationis geni narX aestimata est per delineationem lectionum Mycobacterium bovis AF2122/97. Locum SNP commendatum in area recombinationis confirma applicando criteria in sectione methodi memorata (saltem 20 lectiones et frequentia mutationis 0.9). Polymorphismus geni narX plene confirmatus est in genomis Mb1792361 et Mb7240415 (2.3%).
Visualizatio accurata dispositionis regionis recombinationis copiarum Mycoplasmatis bovis genum pks12 afficientes. Nullae lacunae aut nucleotida indefinita in regione recombinationis nodorum internorum inventa sunt. Quod ad eventum attinet ad genum pks12 afficientem, qui possibilem polyketid synthasem codificat, solum genomum Eu2 continet. Qualitas sequentiationis pks12 per mappationem lectionis Mycobacterium bovis AF2122/97 aestimata est. Locum SNP commendatum in area recombinationis confirma, criteria in sectione methodi memorata applicando (saltem 20 lectiones et frequentia mutationis 0.9). Polymorphismi genomatum Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, et Mb1960 plene confirmati sunt.
Gena PE et PPE regiones repetitivas habent quae facile a sequentiatione et errore mappandi Illumina perperam leguntur, itaque plerumque e fluxu bioinformatico membrorum M. tuberculosis delentur tantum cum strategia mappandi ad sequentiam adhibetur. Coniectura eventuum recombinationis in hoc opere adhibita innititur assemblationi de novo sine eliminatione PE/PPE. Credimus, tribus methodis et algorithmis complementariis per SplitsTree, Gubbins pipeline et programmata RDP4 implementatis, strategias adhibitas robustas esse ad regiones reorganizatas, quae a signis erroris causantur, tractandas et filtrandas. Tamen, ut interferentia geni PE/PPE in programmatibus Gubbins et RDP4 ad greges SNP identificandos, et ergo identificatio regionum recombinationis quae gena narX et pks12 afficere propositae sunt, excludatur, vicinia horum genorum examinata est (Figura Supplementaria 3-5). In *M. bovis* AF2122/97, gen narX a narK2 et Mb1764c separatur, dum pks12 a Mb2075c et Mb2073c circumdatur (Figura Suppletoria 3-5). Tabula geographica per tabulam synlinealem MAUVE genomi completi generata informationem de conservatione et rearrangemento sequentiae genorum praebet, quattuor partes collineas ostendens, et nulla signa translocationis vel inversionis genomi. Praeterea, analysis complementationis cum sequentia aminoacidorum homologiam in omnibus genomis completis probavit, et nullum PE/PPE in regionibus adiacentibus narX vel pks12 inventum est. Pro narX, unum genomum (Mb0030) inferiorem synonymiae gradum habet quia gen narX ut duo fragmenta (fragmenta 1891 et 1890) identificatum est. Pro pks12, propter similitudines, Mb0030 et Mb003 inferiores synlinearitatis gradus exhibuerunt, dum pks12 in duobus et tribus fragmentis respective identificatum est, diversa dominia proteini repraesentantibus (Figura Supplementaria 3-5). Hac informatione habita ratione, et programmatibus Gubbins et RDP4 ambo analysin peractis, alignationem multiplicem centralem maximae 500 bp in fenestra examinantibus, confirmavimus gen PE/PPE signum recombinationis quod narX et pks12 afficit non impediturum esse.
Quamquam signa recombinationis in hoc datorum congerie detecta residua haberi possint, verum est recombinationem in M. bovis excludi non posse, ergo subiectum ulterioris analysis esse debet, in qua genoma integra ex variis scenariis epidemiologicis ad momentum sequentur.
Comparatio arborum phylogeneticarum ML obtentarum ante et post correctionem recombinationis (Figura 2A, B) ad mutationes significantes in relatione phylogenetica coniecturali non duxit, et stirpes M. bovis in eodem grege congregatae sunt.
Post mappationem 42 lectionum M. bovis nuper sequentiatarum cum genoma referentiali M. bovis AF2122/97, ordinatio SNP continens 1816 positiones polymorphicas obtenta est. Plerique SNP (87.1%) in regione codificante sita sunt, et gena affecta secundum categorias functionales in Bovilist (Figura 6A, B) demonstratas describuntur. Numero totali genorum in unaquaque categoria functionali considerato, gena in categoria "metabolismo lipidorum" plures SNP ostenderunt, deinde "processus parietis cellularis et cellularum" et "metabolismo intermedio et respiratione", quod revelat ea in evolutione M. bovis esse.
Analysis hierarchica collectionis notitiarum *M. bovis* ex Lusitania (n = 42). Numerus totalis SNP relatorum et genorum affectorum pro unaquaque categoria functionali (A). Numerus totalis mutationum synonymarum et non-synonymarum pro categoria functionali relatarum (B).
In scala globali, proportio dN/dS media melior est quam 1.5, quod indicat pressionem evolutionariam globalem esse ad statum ancestralem tollendum et repraesentat condicionem electionis purificationis positivam (diversificatam vel directam) et/vel relaxatam. In categoriis "virulentiae, detoxificationis, adaptationis", "sequentiarum insertionis et phagorum", et "proteinorum regulatoriorum", plus quam duae tertiae partes SNP non sunt synonymae (Figura 6B).
In omnibus categoriis, gena cum multis SNPs inveniuntur, quae mutationis ratam mediam (id est, SNP per gen) maiorem quam 1 efficiunt (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) cum 15 SNPs et fas (Mb2553c) cum 8 SNPs valores mutationis altiores habent. Utrumque horum genorum in metabolismo acidorum pinguium implicatur. Gen pks polyketid synthase (PKS) codificat, quod est enzymum multifunctionale in biosynthesi lipidorum parietis cellularis mycobacterialis implicatum74,75. Hoc gen polypeptidum multifunctionale codificat quod in synthesi mycoketidum implicatur74,76. Gen fas in synthesi acidi mycolici implicatur. Utrumque horum genorum munus magnum in biosynthesi parietis cellularis in contactu cum hospite agit.
Ut evolutio Mycobacterium bovis ulterius investigaretur, duo genera genorum specificorum analysata sunt. Opera antea edita, compositione sequentiae et methodis phylogeneticis utens, gena ab maioribus MTBC per HGT ante diversificationem acquisita identificaverunt37,38. Haec gena in Tabula Supplementi 2 enumerantur. Distributio SNP in summa 77 genorum, quae ad HGT affinia esse possunt, analysata est, et 26 loca polymorphica identificata sunt, quae in plerisque casibus (78%) mutationes non synonymas (NS) effecerunt (Tabula Supplementi 2). Opera priora de genoma MTBC demonstraverunt regionem HGT putativam rationem SNP NS maiorem exhibere comparatam cum reliquo genoma. Si quis putat has regiones recombinationis ab maioribus MTBC acquisitas esse, et ideo polymorphismos antiquos superrepraesentare, tunc proportio mutationum synonymarum maior exspectatur, quia substitutiones NS per selectionem negativam eliminari exspectantur, quia mutationes aminoacidorum functionem proteini mutare possunt. Ergo, nostrae conclusiones indicant consequentias functionales ex substitutione genorum HGT similium oriri posse, quod eorum momentum pro pretiosa diversitate genetica adaptiva reflectit.
Simul cum hac analysi, gena quae partes systematis 3R (reparationis, replicationis, et recombinationis DNA) codificant diligenter examinata sunt secundum indicem antea a dos Vultos et collaboratoribus (2008)39 publicatum. Permutatio fragmentorum DNA identicorum directe observari non potest, quamquam frequens processus esse potest cum bacteria arcte cognata implicantur, ut in casu huius congeriis datorum; praeterea, hic processus clavis ad methodos reparationis DNA72 esse potest, ergo partes in recombinatione homologa agunt. In summa 26 positiones polymorphicae per 54 gena distributae identificatae sunt (Tabula Supplementaria 3). In hoc congerie genorum, mutationes NS circiter 65% consequentiarum explicaverunt, quod cum relationibus prioribus de stirpibus Mycobacterium tuberculosis congruit.
Tempus publicationis: Oct-XXI-MMXXI