પુનર્સંયોજન, પરિવર્તન અને હકારાત્મક પસંદગીના જીનોમ-વ્યાપી અંદાજો માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના વિવિધ ડ્રાઇવરોને પ્રેરણા આપે છે.

નેચરની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં CSS માટે મર્યાદિત સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે બ્રાઉઝરના નવા વર્ઝનનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડ બંધ કરો). તે જ સમયે, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે સ્ટાઇલ અને જાવાસ્ક્રિપ્ટ વિનાની સાઇટ્સ પ્રદર્શિત કરીશું.
જીનોમ સિક્વન્સિંગે ચેપી રોગ સંશોધનના ક્ષેત્રને પુનર્જીવિત કર્યું છે, જેમાં રોગ રોગશાસ્ત્ર, રોગકારકતા, યજમાન-રોગકારક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને રોગકારક પ્રાણીઓ પર લાદવામાં આવેલી ઉત્ક્રાંતિ પ્રક્રિયાનો ખુલાસો થયો છે. માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ કોમ્પ્લેક્સ (MTBC) માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસને તેના પ્રાણી અનુકૂલનશીલ સભ્યોમાંના એક તરીકે માને છે જે પાર્થિવ સસ્તન પ્રાણીઓમાં ટ્યુબરક્યુલોસિસ (TB) નું કારણ બને છે, અને તે બેક્ટેરિયલ ઉત્ક્રાંતિનું એક લાક્ષણિક મોડેલ છે. અન્ય MTBC સભ્યોની જેમ, માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસને કડક રીતે ક્લોન કરાયેલ, ધીમે ધીમે વિકસિત રોગકારક માનવામાં આવે છે, અને સ્પષ્ટપણે પુનઃસંયોજન અથવા આડી જનીન ટ્રાન્સફરના કોઈ સંકેત નથી. આ કાર્યમાં, અમે પશુઓની આનુવંશિક વિવિધતામાં આંતરદૃષ્ટિ મેળવવા માટે વિવિધ વંશાવલિ (યુરોપ અને આફ્રિકા) ના 70 પશુઓ M. થી બનેલા સંપૂર્ણ જીનોમ સિક્વન્સ (WGS) ડેટાસેટ પર તુલનાત્મક જીનોમિક્સ લાગુ કરીએ છીએ. ઉત્ક્રાંતિ શક્તિ. પુનર્ગઠનના સંકેતોનો અંદાજ કાઢવા માટે ત્રણ અલગ અલગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. વૈશ્વિક સ્તરે, બે સ્વતંત્ર પદ્ધતિઓ દ્વારા થોડી સંખ્યામાં પુનઃસંયોજન ઘટનાઓ ઓળખવામાં આવી છે અને પુષ્ટિ કરવામાં આવી છે. તેમ છતાં, પરિવર્તનની તુલનામાં, પુનઃસંયોજન M. bovis ની વિવિધતા પર નબળું અસર કરે છે (એકંદર r/m = 0.037). અમારા ડેટા સેટમાં માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના ક્લોનલ સંકુલમાં મેળવેલ સરેરાશ r/m તફાવત એ સામાન્ય ખ્યાલ સાથે સુસંગત છે કે સમાન વર્ગીકરણ પ્રજાતિઓને સોંપેલ વંશ વચ્ચે પુનઃસંયોજનની ડિગ્રી ખૂબ જ અલગ હોઈ શકે છે. આ કાર્યના આધારે, માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસમાં પુનઃસંયોજનને નકારી શકાય નહીં, તેથી ભવિષ્યના તુલનાત્મક જીનોમિક્સ સંશોધનમાં તે વધુ પ્રયાસોનો વિષય હોવો જોઈએ, જેમાં વિશ્વભરના વિવિધ રોગચાળાના દૃશ્યોમાંથી મોટા ડેટા સેટનો WGS મહત્વપૂર્ણ છે. ત્યારબાદ મલ્ટી-હોસ્ટ ટીબી પ્રચલિતતામાંથી નાના માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ ડેટા સેટ (n = 42) પર વધારાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું, અને 1,800 થી વધુ લોકી ઓળખવામાં આવ્યા, જેમાંથી ઓછામાં ઓછા એક સ્ટ્રેનમાં એક જ ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ (SNP) દર્શાવવામાં આવ્યું. મોટાભાગના (87.1%) કોડિંગ ક્ષેત્રમાં સ્થિત છે, અને સમાનાર્થી ફેરફારોના બિન-સમાનાર્થી ફેરફારો (dN/dS) નો વૈશ્વિક ગુણોત્તર 1.5 થી વધુ છે, જે દર્શાવે છે કે હકારાત્મક પસંદગી એ M. bovis પર લાગુ કરાયેલ એક મહત્વપૂર્ણ ઉત્ક્રાંતિ બળ છે. "લિપિડ મેટાબોલિઝમ", "કોષ દિવાલ અને કોષીય પ્રક્રિયાઓ", અને "મધ્યવર્તી ચયાપચય અને શ્વસન" ની કાર્યાત્મક શ્રેણીઓમાં સમૃદ્ધ જનીનોમાં SNPs નું વધુ પ્રમાણ શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું, જે માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના મહત્વના જીવવિજ્ઞાન અને ઉત્ક્રાંતિમાં તેમની સંભાવના દર્શાવે છે. MTBC પૂર્વજોમાં જનીનો પર નજીકથી નજર નાખવાથી જે આડા જનીન ટ્રાન્સફર માટે સંવેદનશીલ છે અને 3R (DNA રિપેર, પ્રતિકૃતિ અને પુનઃસંયોજન) સિસ્ટમમાં સમાવિષ્ટ છે તે તાઈજીમાના D તટસ્થ પરીક્ષણના વૈશ્વિક સરેરાશ નકારાત્મક મૂલ્યને છતી કરે છે, જે ભૂતકાળના પસંદગીયુક્ત સ્કેનિંગ સૂચવે છે. વસ્તી વિસ્તરણ પછી તાજેતરની અવરોધ હજુ પણ ફરજિયાત રોગકારક માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ માટે યજમાન સામે લડવા માટે મુખ્ય ઉત્ક્રાંતિ પ્રેરક પરિબળ છે.
માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ કોમ્પ્લેક્સ (MTBC) એ બેક્ટેરિયલ પેથોજેન્સના સૌથી સફળ ટેક્સામાંનું એક છે અને બેક્ટેરિયલ ઉત્ક્રાંતિનો એક લાક્ષણિક કેસ છે. તેના સભ્યો જીનોમિક સ્તરે આશ્ચર્યજનક રીતે ઉચ્ચ ન્યુક્લિયોટાઇડ ઓળખ દર્શાવે છે (> 99%)1,2. વિવિધ MTBC ઇકોટાઇપ્સ સૂક્ષ્મ-સસ્તન પ્રાણીઓથી લઈને મનુષ્યો સુધીની વિશાળ શ્રેણીની યજમાન પ્રજાતિઓમાં ટ્યુબરક્યુલોસિસ (TB)નું કારણ બની શકે છે, જે એક ચેપી ગ્રાન્યુલોમેટસ રોગ છે3,4,5. હાલમાં, સંકુલમાં માનવીઓ [M. ટ્યુબરક્યુલોસિસ (Mtb), માયકોબેક્ટેરિયમ આફ્રિકનમ] અને પ્રાણી-અનુકૂલિત પેથોજેન્સ (માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ, માયકોબેક્ટેરિયમ કેપિટમ, માયકોબેક્ટેરિયમ પિનીપેડમ, માયકોબેક્ટેરિયમ માઇક્રોટોબેક્ટર, માયકોબેક્ટેરિયમ મોંગી, માયકોબેક્ટેરિયમ માયસાની, માયકોબેક્ટેરિયમ સુરીકા, "બેસિલસ ચિમ્પાન્ઝી" અને "ડેસી") 5,6નો સમાવેશ થાય છે. એમ. કેનેટ્ટી (જેને "નોડોબેક્ટર ગ્લાબ્રાટા" તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) ઉપરોક્ત માયકોબેક્ટેરિયા સાથે સરેરાશ ન્યુક્લિયોટાઇડ ઓળખ 98% છે, અને તુલનાત્મક જીનોમિક્સ કાર્ય દર્શાવે છે કે એમ. કેનેટ્ટી અને બાકીના MTBC તાજેતરમાં સામાન્ય પૂર્વજથી અલગ થયા છે.7 આ ખ્યાલને ધ્યાનમાં લેતા, કેટલાક લેખકો M. કેનેટ્ટીને MTBC 8 ના સભ્ય કહે છે.
MTBC ને વ્યવસ્થિત રીતે કડક ક્લોનલ સંકુલ તરીકે વર્ણવવામાં આવે છે, અને તેની વસ્તી રચના સ્પષ્ટપણે ઓછી વિવિધતા, અવરોધો, પસંદગીયુક્ત સ્કેનિંગ અને આનુવંશિક પ્રવાહ દ્વારા સંચાલિત થાય છે9,10. ગુમ થયેલ બહુરૂપતા જેવા જટિલ કડક ક્લોનલ ઉત્ક્રાંતિને પુનઃસંયોજન દ્વારા પુનઃસ્થાપિત કરી શકાતી નથી એમ ધારીને. આ પૂર્વધારણાના આધારે, વિભેદક પ્રદેશ (RD) અને TbD1 (Mtb વિશિષ્ટ કાઢી નાખવાનો 1 પ્રદેશ) ના જીનોમિક કાઢી નાખવાની સળંગ ઘટનાઓને MTBC ઉત્ક્રાંતિ2,5,11 ના પરમાણુ માર્કર્સ તરીકે પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવી છે. તુલનાત્મક જીનોમિક્સ અને સંપૂર્ણ જીનોમ સિક્વન્સિંગ (WGS) કાર્ય માનવ-અનુકૂલિત સભ્યોને નવ વંશ (માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ L1 થી L4, L7, અને L8; અને માયકોબેક્ટેરિયમ આફ્રિકનમ L5, L6, અને L9), વંશ L2 થી L4 શેર કરેલ કાઢી નાખવા TbD1 પ્રદેશ2,11,12,13 માં વિભાજનને સમર્થન આપે છે. વધુમાં, પ્રાણી અનુકૂલિત સભ્યો એક સામાન્ય પૂર્વજ શેર કરવાનો પ્રસ્તાવ મૂકે છે, જે RD7, RD8, RD9 અને RD102, 5, અને 14 માં ક્લેડ-વિશિષ્ટ કાઢી નાખવા દ્વારા વ્યાખ્યાયિત થયેલ છે.
આડી જનીન ટ્રાન્સફર (HGT) અને પુનઃસંયોજન ઘટનાઓ દુર્લભ માનવામાં આવે છે અને MTBC ના પૂર્વજોમાં થાય છે, સમગ્ર MTBC સભ્યના અલગ ઇતિહાસને બદલે15,16,17. હ્યુજીસ અને સહયોગીઓ (2002) અને ગુટાકર અને સહયોગીઓ (2006) દ્વારા બે પ્રારંભિક અહેવાલો સૂચવે છે કે પુનઃસંયોજન ઘટનાઓ એમ. ટ્યુબરક્યુલોસિસ સ્ટ્રેન્સ18,19 માં ચોક્કસ સ્થાનને ચિહ્નિત કરતી બહુરૂપતાને આકાર આપવામાં મદદ કરી શકે છે. MTBC માં પુનઃસંયોજનના સ્પષ્ટ અભાવના કારણો છે: (1) યાંત્રિક પ્રક્રિયા અને HGT ની ક્ષમતા ગુમાવવી; (2) HGT ઘટનાઓની દુર્લભતા; (3) MTBC નિશમાં પુનઃસંયોજન ઘટનાઓની કોઈ શક્યતા નથી14,17. તાજેતરમાં, MTBC સ્ટ્રેન 20 અને માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ 21 પર લાગુ કરાયેલા કેટલાક સંપૂર્ણ-જીનોમ સિક્વન્સિંગ (WGS) અભ્યાસોએ પુનઃસંયોજનના પુરાવા પૂરા પાડ્યા છે, જે દર્શાવે છે કે MTBC સ્ટ્રેન્સ ઘણીવાર નાના DNA ટુકડાઓનું વિનિમય કરે છે, પરંતુ મર્યાદિત ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સ ભિન્નતાને કારણે, આ ઘટનાઓ હજુ પણ ધ્યાનમાં આવતી નથી.
માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ એ પશુધન (મુખ્યત્વે પશુઓ) માંથી સૌથી સામાન્ય રીતે પુનઃપ્રાપ્ત થયેલ MTBC સભ્ય છે, જોકે તેને મુક્ત-શ્રેણી અને વાડવાળા જંગલી પ્રાણીઓથી પણ અલગ કરી શકાય છે4,22,23,24. સ્પોલિગોટાઇપિંગ પ્રોફાઇલ, ચોક્કસ ડિલીશન અને ચોક્કસ જનીનોમાં સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ્સ (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 અનુસાર, એમ. બોવિસ પાંચ મુખ્ય ક્લોનલ સંકુલમાં વિકસિત થયા [યુરોપિયન 1 (Eu1), યુરોપિયન 2 (Eu2), યુરોપિયન 3 (Eu3), આફ્રિકન 1 (Af1) અને આફ્રિકા 2 (Af2)]. આ ક્લોનલ સંકુલો માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ વસ્તીની વિવિધ રચના અને ભૌગોલિક પ્રદેશો સાથેના તેના જોડાણને દર્શાવે છે. વધુમાં, ઝિમ્પેલ અને સહયોગીઓ દ્વારા હાથ ધરવામાં આવેલા તાજેતરના WGS કાર્ય (2020) એ માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના SNP પર આધારિત ફાયલોજેની ડિઝાઇન કરી, જેમાં 1,900 થી વધુ જીનોમ હતા, જે દર્શાવે છે કે ઓછામાં ઓછા ચાર અલગ અલગ વંશ (Lb1 થી Lb1 થી Lb4 નામ) છે, તેઓ અગાઉ વ્યાખ્યાયિત ક્લોનલ સંકુલ સાથે સંપૂર્ણપણે સુસંગત નથી, જોકે ભૌગોલિક વિશિષ્ટતાની પણ પુષ્ટિ કરી શકાય છે30. આ લેખકોએ ફાયલોજેની અને મોલેક્યુલર ડેટિંગનું વિભેદક વિશ્લેષણ કર્યું, પરંતુ પુનઃસંયોજન30 નો અભ્યાસ કર્યો નહીં.
સ્પોલિગોટાઇપિંગ, MIRU-VNTR (માયકોબેક્ટેરિયલ ઇન્ટરસ્પર્સ્ડ રિપીટ યુનિટ-વેરિયેબલ ટેન્ડમ રિપીટ નંબર) જેવી વિવિધ મોલેક્યુલર તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને અગાઉના કાર્ય અને તાજેતરના SNP ટાઇપિંગથી M. bovis સ્ટ્રેન્સ 31,32,33, 34,35 માં ચોક્કસ સ્તરની આનુવંશિક વિવિધતા જાહેર થઈ છે. રોગ રોગશાસ્ત્રના અભ્યાસમાં આનુવંશિક વિવિધતાનું ભિન્નતા એક મહત્વપૂર્ણ સાધન બની ગયું છે, જે રોગજન્યતા, વાઇરુલન્સ અને રોગના પ્રસારણની ઊંડાણપૂર્વકની સમજ માટે મદદરૂપ છે. WGS પદ્ધતિનો ઉદભવ માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ જીનોમ દ્વારા વિવિધ યજમાનો અને રોગશાસ્ત્રના દૃશ્યોમાં અનુકૂલન અને દ્રઢતાની પ્રક્રિયામાં લાદવામાં આવેલા ઉત્ક્રાંતિ પ્રેરક પરિબળોને જાહેર કરવાની શક્યતા પૂરી પાડે છે.
આ કાર્યમાં, અમે વિવિધ માયકોપ્લાઝ્મા બોવિસ ડેટાસેટ્સ (n=70) પર તુલનાત્મક જીનોમિક વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીએ છીએ, જેમાં વિવિધ ક્લોનલ સંકુલમાંથી આઇસોલેટ્સનો સમાવેશ થાય છે, જેથી માયકોપ્લાઝ્મા બોવિસની ઉત્ક્રાંતિ પ્રક્રિયામાં આંતરદૃષ્ટિ મેળવી શકાય, ખાસ કરીને ફાયલોજેનેટિક સંબંધો અને પુનઃસંયોજન ઘટનાઓને ઉકેલવા માટે. આ વિશ્લેષણના પૂરક તરીકે, પોર્ટુગલ 31,36 માં સારી રીતે લાક્ષણિકતા ધરાવતા મલ્ટી-હોસ્ટ ટ્યુબરક્યુલોસિસ વિસ્તારમાંથી મેળવેલા M. બોવિસ આઇસોલેટ્સ (n = 42) ના સબ-ડેટા સેટને બિન-ઓળખનું અનુમાન કરવા માટે વધુ શોધ કરવામાં આવી હતી. સમાનાર્થી (dS) ન્યુક્લિયોટાઇડ અવેજીમાં ઇન્દ્રિય (dN) ના સંબંધિત ગુણોત્તર, તેમજ સાહિત્યમાં ઉલ્લેખિત ચોક્કસ જીનોમના ઉત્ક્રાંતિ યોગદાન વચ્ચેનું સંતુલન, તેઓ HGT દ્વારા MTBC પૂર્વજો દ્વારા મેળવેલા 37,38 છે, અને 3R (DNA રિપેર, પ્રતિકૃતિ અને પુનઃસંયોજન) સિસ્ટમ જનીન ઘટકો 39 ને એન્કોડ કરે છે. HGT દ્વારા મેળવેલા જનીનો પસંદ કરો કારણ કે તેઓ પ્રાચીન પોલીમોર્ફિઝમનું પ્રતિનિધિત્વ કરી શકે છે, તેથી એવી અપેક્ષા રાખવામાં આવે છે કે તેમાં સમાનાર્થી ફેરફારોનું પ્રમાણ વધુ હોઈ શકે છે. 3R સિસ્ટમમાં સમાવિષ્ટ જનીનો પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા કારણ કે M. ટ્યુબરક્યુલોસિસ સ્ટ્રેન પરના અગાઉના કાર્યમાં આ જનીનો પર કામ કરતા સામાન્ય નકારાત્મક/શુદ્ધિકરણ પસંદગીઓ સૂચવવામાં આવી હતી, અને તેઓ ઉત્ક્રાંતિ 39 માં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવી શકે છે. આ કાર્યનો બીજો ધ્યેય પુનર્ગઠન ઘટનાઓના અસ્તિત્વનું અનુમાન લગાવવાનો છે. આ કારણોસર, પોર્ટુગલના અમારા ડેટાસેટમાં ફક્ત યુરોપિયન ક્લોન કોમ્પ્લેક્સ 2 ના જીનોમ અને ક્લોન કોમ્પ્લેક્સ સોંપેલ ન હોય તેવા સ્ટ્રેન શામેલ છે તે ધ્યાનમાં લેતા, અમે આખરે બધા ક્લોન કોમ્પ્લેક્સના પ્રતિનિધિ મેળવવા માટે જાહેરમાં ઉપલબ્ધ જીનોમ ડેટાનો સમાવેશ કરવાનું નક્કી કર્યું, અને પરિણામોની મજબૂતાઈ અને પહોળાઈમાં સુધારો કર્યો.
પોર્ટુગીઝ સ્થાનિક મલ્ટી-હોસ્ટ ટ્યુબરક્યુલોસિસ સીન (નીચે વિગતો), જે અગાઉ રોગચાળાના દ્રષ્ટિકોણથી દર્શાવવામાં આવી હતી, 36, આ કાર્યનું કેન્દ્ર છે. પોર્ટુગલના ડેટા સેટમાં ફક્ત યુરોપિયન 2 ક્લોન સંકુલ અને નિયુક્ત સંકુલ વિનાના સ્ટ્રેનના પ્રતિનિધિઓ છે તે ધ્યાનમાં લેતા, જાહેરમાં ઉપલબ્ધ સંપૂર્ણ-જીનોમ સિક્વન્સિંગ ડેટા ડેટા સેટને વિસ્તૃત કરવા માટે ઉમેરવામાં આવ્યો છે જેમાં M. bovis ક્લોન સંકુલના બધા પ્રતિનિધિઓનો સમાવેશ થાય છે. તેથી, આ કાર્યમાં ત્રણ સંપૂર્ણ-જીનોમ સિક્વન્સિંગ ડેટા સ્ત્રોતોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો: સંપૂર્ણ/ડ્રાફ્ટ જીનોમ એસેમ્બલી, NCBI (નેશનલ સેન્ટર ફોર બાયોટેકનોલોજી ઇન્ફર્મેશન) માં સંગ્રહિત 10 સ્કેફોલ્ડ્સ સુધી (n = 15 આઇસોલેટ્સ); SRA માં સંગ્રહિત (સિક્વન્સ રીડ આર્કાઇવની ઇલુમિના ફાસ્ટક્યુ ફાઇલ) એમ. બોવિસ ક્લોન્સ (n = 12 આઇસોલેટ્સ) 30 ની જટિલ વિવિધતા દર્શાવે છે; અને પોર્ટુગલના 42 નવા સિક્વન્સ કરેલા જીનોમ. માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ BCG (બેસિલ કેલ્મેટ-ગ્યુરિન) ને NCBI શોધમાંથી બાકાત રાખવામાં આવ્યું હતું. ડેટાસેટમાં સમાવિષ્ટ કરવા માટે સામાન્ય રીતે M. bovis AF2122/97 નો ઉપયોગ સંદર્ભ જીનોમ તરીકે થાય છે. આફ્રિકન 1 ક્લોનિંગ કોમ્પ્લેક્સ દ્વારા રજૂ કરાયેલા સમગ્ર જીનોમ ક્રમની જાહેર ઉપલબ્ધતા ન હોવાને કારણે, અને Af2 અને Eu1 ના પ્રતિનિધિ સ્ટ્રેનમાંથી જીનોમની સંખ્યા ઓછી હોવાથી, SRA દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ મૂળ સિક્વન્સિંગ ડેટાનો ઉપયોગ આ કિસ્સાઓમાં કરવામાં આવ્યો હતો. ઝિમ્પેલ અને તેના સહયોગીઓ (2020) ના કાર્યથી ઉપરોક્ત ક્લોનિંગ કોમ્પ્લેક્સમાંથી જીનોમ ઓળખવામાં મદદ મળી અને ડેટા સેટમાં સમાવેશ માટે માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ પસંદ કરવામાં મદદ મળી. Eu3 માટે, ફક્ત એક જ પ્રકારનો જીનોમ વર્ણવવામાં આવ્યો છે (બ્રેન્જર એટ અલ., 2020), તેથી અમે જે જીનોમનો સમાવેશ કરીએ છીએ તે Eu3 કોમ્પ્લેક્સનો એક અલગ પ્રતિનિધિ છે.
વૈશ્વિક સ્તરે, આ ડેટા સેટમાં ૧૯૮૫ થી ૨૦૧૬ દરમિયાન ૧૨ દેશોમાં વિતરિત ૮ યજમાન પ્રજાતિઓમાંથી ૭૦ પશુઓ એમ. બોવિસનો સમાવેશ થાય છે. ૩૬ પ્રજાતિઓને Eu2 તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવી છે, ૭ પ્રજાતિઓ Eu1 છે, ૧ પ્રજાતિ Eu3 છે, ૩ પ્રજાતિઓ Af1 છે, ૪ પ્રજાતિઓ Af2 છે અને ૧૯ કોઈપણ ક્લોનલ સંકુલને આભારી નથી (નીચે વિગતો). આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસની વિગતવાર માહિતી (પ્રવેશ નંબર સહિત) કોષ્ટક ૧ અને પૂરક કોષ્ટક ૧ માં દર્શાવેલ છે.
પોર્ટુગલના પ્રાણી ક્ષય રોગના હોટસ્પોટ્સમાંથી માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના 42 નવા ક્રમબદ્ધ સંપૂર્ણ જીનોમ અને 12 વર્ષથી વધુ સમયથી વિતરિત આ અભ્યાસનું કેન્દ્ર છે, કારણ કે સંભવિત વન્યજીવન-પશુધન રોગ પ્રણાલીઓનું નિયમિતપણે નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું છે 31,36 (પૂરક આકૃતિ 1). અનુગામી પ્રક્રિયાઓ અનુસાર, 2003 થી 2015 દરમિયાન આ જાતોને પશુઓ (n = 14), લાલ હરણ (n = 16) અને જંગલી ડુક્કર (n = 12) માંથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા: ભલામણ કરેલ પ્રોટોકોલ માર્ગદર્શિકા અનુસાર પ્રાણીઓને એકત્રિત કરો અને સંભાળો. પેશીના નમૂનાઓ OIE ટેરેસ્ટ્રીયલ એનિમલ હેન્ડબુકમાં છે અને સ્ટોનબ્રિંક અને લોવેન્સ્ટાઇન-જેન્સન પાયરુવેટ ઘન માધ્યમ અને પ્રવાહી માધ્યમ પર ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવે છે. સંસ્કૃતિઓને 37 °C પર ઉકાળવામાં આવે છે અને ઓછામાં ઓછા 12 અઠવાડિયા માટે અઠવાડિયામાં એકવાર વૃદ્ધિ તપાસવામાં આવે છે. વસાહતોને -80ºC પર ગ્લિસરોલ દ્રાવણમાં સીધા સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે. માયકોબેક્ટેરિયમ સિલેક્ટિવ માધ્યમ (મિડલબ્રુક 7H9, BD ડાયગ્નોસ્ટિક્સ) માં, WGS પ્રોગ્રામના DNA મેળવવા માટે મૂળ આર્કાઇવ કરેલા નમૂનાઓને સિંગલ ઇન વિટ્રો પેસેજ ઇન વિટ્રોમાંથી પસાર કરવામાં આવ્યા હતા. આ માટે, ફ્રોઝન કલ્ચર સ્ટોક સોલ્યુશનને 5% સોડિયમ પાયરુવેટ અને 10% ADS (50 ગ્રામ આલ્બ્યુમિન, 20 ગ્રામ ગ્લુકોઝ, 1 લિટર પાણીમાં 8.5 ગ્રામ સોડિયમ ક્લોરાઇડ) સાથે મિડલબ્રુક 7H9 પર 37°C રીટ્રેન પર સમૃદ્ધ બનાવવામાં આવ્યું હતું. 4 અઠવાડિયાના વિકાસ પછી, માધ્યમનું નવીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું અને વૃદ્ધિ જોવા મળે ત્યાં સુધી કલ્ચરનું નિયમિત નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. કોષોને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કાપવામાં આવ્યા હતા, પેલેટને 500 µL ફોસ્ફેટ બફર સલાઇન (PBS) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું, 99 °C પર 30 મિનિટ માટે ગરમ કરવામાં આવ્યું હતું, સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું, અને સુપરનેટન્ટને WGS સુધી -20 °C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. બધી પ્રક્રિયાઓ લેવલ 3 બાયોસેફ્ટી સુવિધાઓમાં કરવામાં આવે છે.
WGS પેર-એન્ડ જીનોમ લાઇબ્રેરી દરેક DNA નમૂનાના અનન્ય ઇન્ડેક્સનો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવે છે, અને સિક્વન્સિંગ માટે ઇલુમિના MiSeq (2 × 250 pb) (40 નમૂનાઓ) અને HiSeq (2 × 150 pb) (બે આઇસોલેટ્સ) ટેકનોલોજી (યુરોફિન્સ જીનોમિક્સ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરે છે. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર, જીનોમિક DNA ને સિક્વન્સ કરવા માટે ડબલ-એન્ડેડ મોડ્યુલ જોડાણ સાથે ઇલુમિના જીનોમ એનાલાઇઝરનો ઉપયોગ કરો, અને લાઇબ્રેરી બનાવવા માટે ઇલુમિના તરફથી Nextera XT DNA લાઇબ્રેરી પ્રેપ કીટનો ઉપયોગ કરો.
SRA (n = 12) માંથી પ્રાપ્ત થયેલા ડેટાને ધ્યાનમાં લેતા, ક્લોન સંકુલની ઓળખનો ઉપયોગ સંબંધિત પ્રકાશન 30, 41, 43 ના મેટાડેટા તરીકે થઈ શકે છે. સંપૂર્ણ જીનોમને ધ્યાનમાં લેતી વખતે, માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ AF2122/97 અને માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ 3601 સિવાય, જે અનુક્રમે Eu1 અને Eu3 ક્લોનલ સંકુલ 25, 29 ના માન્ય સભ્યો છે, તે માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ H37Rv (NCBI એક્સેસિયન નંબર NC_000962.3) ના સંપૂર્ણ જીનોમ જેવું જ છે. જીનોમ સંરેખણ MAFFT (એમિનો એસિડ અથવા ન્યુક્લિયોટાઇડ ક્રમનો બહુવિધ સંરેખણ કાર્યક્રમ, સંસ્કરણ 7.458) અને પરિમાણ -addfragments48 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે. પછી, વિવિધ ક્લોનલ સંકુલની ગેરહાજરી અને/અથવા SNP સુવિધાઓની હાજરી માટે શોધ કરો.
નવા ક્રમબદ્ધ માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ (n = 42) અને એસેમ્બલ જીનોમ ડ્રાફ્ટ (n = 3) ના મૂળ વાંચન, vSNP પાઇપલાઇન દ્વારા સંદર્ભ જીનોમ માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ H37Rv સાથે સંકુલને સંરેખિત કરે છે અને વિવિધ ક્લોન્સના ડિલીટ અને/અથવા SNP લક્ષણોની હાજરી શોધ હાથ ધરવામાં આવી હતી.
સંબંધિત ક્લોનલ કોમ્પ્લેક્સને જીનોમિક ડેટા સોંપવા માટે સુવિધાઓના અભાવ અને/અથવા SNP અને સ્પોલિગોટાઇપિંગ પ્રોફાઇલ્સની હાજરી/ગેરહાજરીમાંથી માહિતી એકત્રિત કરો. ચાર ડ્રાફ્ટ એસેમ્બલીઓ માટે, સ્પોલિગોટાઇપિંગ પ્રોફાઇલનું અનુમાન લગાવી શકાતું નથી, તેથી તેમને "કોઈ જટિલતા નથી" જૂથમાં સમાવવામાં આવ્યા છે.
આ કાર્ય પછી બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ વર્કફ્લો ડી નોવો એસેમ્બલી અને મેપિંગથી શરૂ થાય છે, જેનો ઉદ્દેશ્ય રિકોમ્બિનેશન ઇવેન્ટ્સ અને ચોક્કસ જીનોમ પોલીમોર્ફિઝમ્સનું અન્વેષણ કરવાનો છે. આકૃતિ 1 અનુસરવામાં આવેલા પગલાંઓનો ફ્લોચાર્ટ પ્રદાન કરે છે. રિકોમ્બિનેશન વિશ્લેષણ માટે, બધા જીનોમનો ઉપયોગ અનુમાન અને સંબંધિત સૂચકાંકોની મજબૂતાઈ વધારવા માટે થાય છે.
જીનોમ કન્સેન્સસ સિક્વન્સના જનરેશનમાં ભૂલો ઘટાડવા માટે, અમે પહેલા ડી નોવો એસેમ્બલી મેળવી, અને પછી કોર મલ્ટીપલ એલાઈનમેન્ટ્સ મેળવ્યા. યુનિસાયક્લર પાઇપલાઇન હાલમાં https://github.com/rrwick/Unicycler49 પર ઉપલબ્ધ છે અને તેનો ઉપયોગ 54 સિક્વન્સ્ડ જીનોમ (42 નવા સિક્વન્સ્ડ અને SRA માંથી રિકવર કરાયેલ 12 ફાસ્ટક્યુ ફાઇલો) ની ડી નોવો એસેમ્બલી કરવા માટે થાય છે. ટૂંકમાં, શરૂઆતથી એસેમ્બલ કરતા પહેલા, FastQC વર્ઝન 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), અને Trimmomatic વર્ઝન 0.36 ("રીડ્સમાંથી એડેપ્ટરો અને અન્ય લાઇટિંગ-વિશિષ્ટ સિક્વન્સ કાપવા" અને "રીડના અંતમાંથી બેઝ કાપો, જો 20 ની થ્રેશોલ્ડ ગુણવત્તા કરતા ઓછી હોય" વિકલ્પ લાગુ કરવામાં આવે છે) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50 માં વાંચન ગુણવત્તા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પછી, જીનોમ એસેમ્બલી માટે SPAdes optimiser49 નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને પોસ્ટ-એસેમ્બલી ઑપ્ટિમાઇઝેશન માટે Pilon વર્ઝન 1.1851 નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ખોટી એસેમ્બલી ટાળવા માટે એક રૂઢિચુસ્ત બ્રિજિંગ મોડ પસંદ કરવામાં આવ્યો હતો, અને k-mer કદ વાંચન લંબાઈના 20% અને 95% વચ્ચે શોધવામાં આવ્યું હતું અને પસંદ કરવામાં આવ્યું હતું. SPAdes માર્ગદર્શિકાઓનું પાલન કરો અને વાંચન કદ ધ્યાનમાં લો, 300 bp કરતા નાના કોન્ટિગ્સને કાઢી નાખો અને 52 નો 20 વાંચન ઊંડાઈ કવરેજ કટઓફ સ્થાપિત કરો. ડી નોવો એસેમ્બલી વ્યૂહરચનામાં, અત્યંત પુનરાવર્તિત પ્રોલાઇન-ગ્લુટામેટ (PE) અને પ્રોલાઇન-પ્રોલાઇન ગ્લુટામેટ (PPE) પેરાલોગ્સ જેવા જીનોમિક પ્રદેશો દૂર કરવામાં આવ્યા ન હતા.
ડી નોવો એસેમ્બલીની ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન QUAST પાઇપલાઇન (http://quast.sourceforge.net/quast.html) દ્વારા કરવામાં આવે છે, જે કોન્ટિગ અને M. bovis AF2122/97 સંદર્ભ જીનોમ (NCBI એક્સેસિયન નંબર LT708304.1) મેપિંગ (ગુણવત્તા પરિમાણો માટે પૂરક કોષ્ટક 1 જુઓ) ના નવીકરણને સરળ બનાવે છે.
vSNP પાઇપલાઇન (https://github.com/USDA-VS/vSNP) ની મદદથી, ઇલુમિના સિક્વન્સિંગમાંથી નવા સિક્વન્સ્ડ M. bovis ની FASTQ ફાઇલની સરખામણી M. bovis AF2122/97 રેફરન્સ જીનોમ (LT708304.1)) સાથે કરવામાં આવે છે. જીનોમ એનાલિસિસ ટૂલકીટ (GATK) 53, 54, 55 ની શ્રેષ્ઠ પ્રેક્ટિસ ભલામણો અનુસાર, રિકલિબ્રેશન માટે પ્રમાણભૂત ફિલ્ટર પરિમાણો અથવા વેરિઅન્ટ માસ સ્કોર લાગુ કરો. પરિણામોને 150 અને AC = 2 ના સૌથી ઓછા SAMtools માસ સ્કોરનો ઉપયોગ કરીને ફિલ્ટર કરવામાં આવે છે. દૂષણને નકારી કાઢવા માટે રીડિંગ્સ તપાસવા માટે ક્રેકેન (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) નો પણ ઉપયોગ કરો. અમારા કાર્યમાં મેપ ટુ સિક્વન્સ વ્યૂહરચના માટે વપરાતી vSNP પાઇપલાઇન વ્યાખ્યાયિત SNPs અને લક્ષ્યોની શ્રેણીની તપાસ કરે છે, અને મિશ્ર ચેપ દૃશ્યોને પણ બાકાત રાખે છે. રીડ જીનોમ કવરેજ 99% કરતા વધુ સારું છે (પૂરક કોષ્ટક 1).
મેપિંગ ભૂલો અને ખોટા SNPs ટાળવા માટે, નીચેના કિસ્સાઓમાં એક પ્રકાર ફિલ્ટર કરો: (1) તે 20 થી ઓછા રીડિંગ્સ દ્વારા સમર્થિત છે, (2) તે 0.9 કરતા ઓછી આવર્તન સાથે જોવા મળે છે, (3) તે ઓછામાં ઓછા એક સ્ટ્રેનમાં છે, પરંતુ ઓછામાં ઓછા બીજા સ્ટ્રેનમાં ગાબડા છે. ઇન્ટિગ્રેટેડ જીનોમિક્સ વ્યૂઅર (IGV) વર્ઝન 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 નો ઉપયોગ મેપિંગ અથવા ગોઠવણી સમસ્યાઓવાળા SNPs અને સ્થાનોને દૃષ્ટિની રીતે ચકાસવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. પ્રોલાઇન-ગ્લુટામેટ (PE) અને પ્રોલાઇન-પ્રોલાઇન ગ્લુટામેટ (PPE) જનીનો ખૂબ જ ડુપ્લિકેટ હોવાથી અને બહુ-જીન પરિવારનો ભાગ હોવાથી, તેઓ ઇલુમિના સિક્વન્સિંગ અને મિસમેપિંગ દ્વારા સરળતાથી ગેરસમજ થાય છે, તેથી તેમને પ્રાધાન્ય આપવામાં આવે છે. SNPs ની પુષ્ટિ કરવા માટે મેપિંગ ટુ સિક્વન્સની વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરતી વખતે માયકોબેક્ટેરિયલ બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ વર્કફ્લો ટ્યુબરક્યુલોસિસ કોમ્પ્લેક્સના સભ્યોને દૂર કરે છે. તેથી, અમે વિશ્લેષણમાંથી PE/PPE જનીનો અને ઇન્ડેલ્સને ફિલ્ટર કર્યા.
બોવિલિસ્ટ (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) અનુસાર, બધા SNP ને કાર્યાત્મક શ્રેણીઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા છે. SnpEff પાઇપલાઇન (https://pcingola.github.io/SnpEff/) નો ઉપયોગ SNP પરિણામો (સમાનાર્થી અથવા બિન-સમાનાર્થી ફેરફારો) અનુમાન કરવા માટે થાય છે. માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ AF2122/97 જીનોમ (LT708304.1) નો નવો ડેટાબેઝ બનાવ્યો.
કોર જીનોમ મલ્ટીપલ એલાઈનમેન્ટ Parsnp v1.2 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું, જે હાલમાં https://github.com/marbl/parsnp57 પર ઉપલબ્ધ છે, જેમાં 69 સંપૂર્ણ જીનોમ/ડ્રાફ્ટ એસેમ્બલી (વિકલ્પ -c સાથે) અને M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) નો સંદર્ભ તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે. ચાર કોર મલ્ટીપલ એલાઈનમેન્ટ્સ કરવામાં આવ્યા હતા: ફક્ત Eu2 ક્લોનિંગ કોમ્પ્લેક્સ (n = 37) ના સભ્યો, જેમાં યુરોપિયન ક્લોનિંગ કોમ્પ્લેક્સ (n = 44) ના બધા સભ્યોનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં યુરોપિયન અને આફ્રિકન ક્લોનિંગ કોમ્પ્લેક્સ (n = 51) ના જંકશન પોઈન્ટનો સમાવેશ થાય છે, અને આ અભ્યાસમાં બધા માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસનો સમાવેશ થાય છે (n = 70).
Parsnp દ્વારા જનરેટ કરાયેલ કોર એલાઈનમેન્ટનો ઉપયોગ RAxML નો ઉપયોગ કરીને CIPRES સાયન્સ ગેટવે v3.3 (http://www.phylo.org/)58 નો ઉપયોગ કરીને મહત્તમ સંભાવના (ML) ફાયલોજેનેટિક ટ્રીનું અનુમાન કરવા અને 1000 માર્ગદર્શિત પ્રતિકૃતિઓ કરવા માટે થાય છે.
સમાંતર રીતે પુનઃસંયોજન ઘટનાઓની હાજરી તપાસવા માટે ત્રણ અલગ અલગ અલ્ગોરિધમ્સ અને બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ ટૂલ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે: સ્પ્લિટ્સટ્રી4 સોફ્ટવેર, ગુબિન્સ (ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સમાં પુનઃસંયોજન દ્વારા નિષ્પક્ષ વંશ) પાઇપલાઇન, અને RDP4 (પુનઃસંયોજન શોધ કાર્યક્રમ, સંસ્કરણ બીટા 4.101) સોફ્ટવેર.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 માં અમલમાં મુકાયેલ વિભાજીત વિઘટન પદ્ધતિનો ઉપયોગ આંકડાકીય ચકાસણી માટે Phi ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને, રૂટલેસ ફાયલોજેનેટિક નેટવર્કની ગણતરી કરવા માટે થાય છે, અને મહત્વ થ્રેશોલ્ડ p = 0.05 છે. Parsnp ના કોર મલ્ટિ-એલાઈનમેન્ટ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ ઇનપુટ તરીકે થાય છે, અને નેટવર્ક સ્ટાન્ડર્ડ તરીકે વિભાજીત વિઘટનને સાકાર કરવામાં આવે છે.
ગુબિન્સ પાઇપલાઇન v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ પર રિકોમ્બિનેશનની અસરનું મૂલ્યાંકન કરવાની બીજી રીત તરીકે ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે ચાલે છે. પાઇપલાઇનમાં અમલમાં મૂકાયેલ અલ્ગોરિધમ સંબંધિત ક્લોન વંશનું પુનર્નિર્માણ કરે છે. અમારા ડેટા સેટની સંપૂર્ણ જીનોમ/ડ્રાફ્ટ એસેમ્બલી અને સંદર્ભ જીનોમ (બોવાઇન બોવિડ AF2122/97, LT708304.1) પરસ્પર છે; અને રિકોમ્બિનેશન ઘટનાનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા SNP ક્લસ્ટરને શોધવા માટે વૃક્ષની દરેક શાખા પર SNP ની સ્થિતિ સ્કેન કરો. શાખાનો શૂન્ય ધારો કે કોઈ રિકોમ્બિનેશન ઘટના નથી, જેનો અર્થ એ છે કે શાખા પર થતા SNP સમાનરૂપે વિતરિત થવા જોઈએ. Parsnp માંથી કોર મલ્ટિપલ એલાઇનમેન્ટ અને RAxML માંથી શ્રેષ્ઠ સ્કોર કરેલ ML ટ્રીનો ઉપયોગ ઇનપુટ ફાઇલો તરીકે થાય છે.
છેલ્લે, ગુબિન્સ પાઇપલાઇન દ્વારા સૂચવેલા પુનર્ગઠન ઘટનાની પુષ્ટિ કરવા માટે, RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 અને SiScan66) માં અમલમાં મુકાયેલા છ અલ્ગોરિધમ્સ ડિફોલ્ટ સેટિંગ્સ હેઠળ Parsnp ના કોર મલ્ટિપલ એલાઇનમેન્ટ પર લાગુ કરવામાં આવે છે. અમે નક્કી કર્યું છે કે RDP4 માં અમલમાં મુકાયેલા ઓછામાં ઓછા ત્રણ અલ્ગોરિધમ્સે દરેક રિકોમ્બિનેશન ઇવેન્ટને ચકાસવા માટે સતત એક મહત્વપૂર્ણ સંકેત દર્શાવવો જોઈએ.
ગુબિન્સ અને RDP સોફ્ટવેર બંને 500 bp સુધીની વિન્ડોમાં કોર મલ્ટીપલ એલાઈનમેન્ટ્સ ચકાસીને રિકોમ્બિનેશન સિગ્નલો શોધે છે અને પુષ્ટિ કરે છે કે ડી નોવો એસેમ્બલી દરમિયાન PE/PPE જનીનોનો સમાવેશ મળેલા રિકોમ્બિનેશન સિગ્નલોમાં દખલ કરશે નહીં, વધુ વિશ્લેષણ હોમોલિનિયરિટી દ્વારા કરવામાં આવે છે. રિકોમ્બિનેશન ઘટનાને ઓળખતા જનીનની નજીકની જગ્યા તપાસો. સ્થાનિક જીનોમ ટ્રાન્સલોકેશન અથવા વ્યુત્ક્રમોને બાકાત રાખવા માટે સંપૂર્ણ જીનોમનો ઉપયોગ કરીને સિનલાઇનર નકશો MAUVE-મલ્ટી-જીનોમ એલાઈનમેન્ટ (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) નો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવ્યો હતો. વધુમાં, SyntTax વેબ સર્વર (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) દ્વારા એમિનો એસિડ સિક્વન્સ પર હોમોલિનિયરિટી વિશ્લેષણ કરવા માટે સમગ્ર જીનોમનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
પોર્ટુગીઝ મલ્ટી-હોસ્ટ ટ્યુબરક્યુલોસિસ સિસ્ટમમાંથી મેળવેલા જીનોમ ડેટા સેટનું વધુ ઊંડાણપૂર્વક વિશ્લેષણ સાહિત્યમાં ઉલ્લેખિત જનીનોના બહુરૂપતાને ચકાસવા માટે છે. આ જનીનો 37,38 છે અને HGT (DNA રિપેર, રેપ્લિકેશન અને રિકોમ્બિનેશન) સિસ્ટમ ઘટકો 39 દ્વારા MTBC પૂર્વજો દ્વારા મેળવેલ જનીન એન્કોડિંગ 3R છે. જનીન વિવિધતા અને ન્યુક્લિયોટાઇડ વિવિધતા (π) અને તાજીમાના D ન્યુટ્રલ ટેસ્ટ પેરામીટર ઇનપુટની ગણતરી કરવા માટે ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) અને DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) નો ઉપયોગ કરો.
69 માયકોપ્લાઝ્મા બોવિસ આઇસોલેટ્સ અને સંદર્ભ જીનોમ પર આધારિત મહત્તમ સંભાવના (ML) ફાયલોજેનેટિક વૃક્ષ મેળવવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 2A). સિંગલ-જીન-આધારિત વૃક્ષો અથવા મલ્ટી-લોકસ-આધારિત વૃક્ષોની તુલનામાં, આ વ્યૂહરચના વધુ શક્તિશાળી વૃક્ષોના ઉત્પાદનને મંજૂરી આપે છે જે સમગ્ર જીનોમની પરિવર્તનશીલતાને કેપ્ચર કરતા નથી અને તેથી પ્રજાતિઓ 68,69 વચ્ચે ભેદ પાડવાની ઓછી ક્ષમતા દર્શાવે છે. ML વૃક્ષનું ટોપોલોજીકલ માળખું સામાન્ય રીતે ક્લોન્સના જટિલ વર્ગીકરણ સાથે સુસંગત હોય છે. Eu2 નો જીનોમ એક શાખામાં ક્લસ્ટર થયેલ છે, અને Af1 નો જીનોમ પણ એકસાથે ક્લસ્ટર થયેલ છે (આકૃતિ 2A). પરિણામ માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના જાણીતા ઉત્ક્રાંતિ સંબંધ સાથે પણ સુસંગત છે, એટલે કે, Eu1 સભ્ય અને અન્ય તમામ ક્લોનલ સંકુલ અને જીનોમ ધરાવતા જૂથ વચ્ચે મોટો તફાવત છે, પરંતુ ક્લોનલ સંકુલ 30 સ્પષ્ટ થયેલ નથી. ક્લોનલ કોમ્પ્લેક્સ અને ફાયલોજેનેટિક ટ્રી પર જોવા મળતા સંબંધ વચ્ચેની નાની અસંગતતા એ હકીકત દ્વારા સમજાવી શકાય છે કે ક્લોનલ કોમ્પ્લેક્સ ચોક્કસ જીનોમિક પ્રદેશોના આધારે વર્ણવવામાં આવે છે, જ્યારે ફાયલોજેનેટિક ટ્રી સમગ્ર જીનોમનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા કોર જીનોમના બહુવિધ ગોઠવણી પર આધારિત છે.
મહત્તમ શક્યતા ફાયલોજેનેટિક વૃક્ષ (GTR) માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ જીનોમના મુખ્ય જીનોમ સંરેખણ (A) પહેલાં અને (B) રિકોમ્બિનેશન સાઇટને દૂર કર્યા પછીના આધારે બનાવવામાં આવે છે. શાખાના રંગો માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ ક્લોન સંકુલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે: યુરોપ 1 જાંબલી છે, યુરોપ 2 લાલ છે, યુરોપ 3 વાદળી છે, આફ્રિકા 1 નારંગી છે, અને આફ્રિકા 2 લીલો છે. વૃક્ષ મૂળ છે અને સ્કેલ પર ખેંચાય છે, અને શાખાની લંબાઈ દરેક સાઇટ માટે રિપ્લેસમેન્ટ તરીકે માપવામાં આવે છે.
માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ સંકુલને ક્લોનલી વિકસિત તરીકે વર્ણવવામાં આવે છે, અને વર્ષોથી સંચિત થયેલા મોટાભાગના પુરાવા એ વિચારને સમર્થન આપે છે કે ચાલુ HGT અને પુનઃસંયોજન ઘટનાઓ MTBC15,17,18 ના શોધી શકાય તેવા સ્તરે થશે નહીં.
અગાઉના કાર્ય દર્શાવે છે કે MTBC સ્ટ્રેન્સ વચ્ચે મર્યાદિત પુનઃસંયોજન હોઈ શકે છે20,21, જ્યારે અન્ય માપી શકાય તેવા પુનઃસંયોજન ઘટનાઓને ઓળખવામાં નિષ્ફળ ગયા છે70,71. માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરીને આ મુદ્દાની ફરીથી ચર્ચા કરો, જે અગાઉના કાર્ય કરતા અલગ છે જેમાં ફક્ત માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ 70,71 ગણવામાં આવ્યા હતા; અથવા MTBC ને સંપૂર્ણ રીતે ધ્યાનમાં લો, જેમાં લગભગ કોઈ M. bovis 20 નું પ્રતિનિધિત્વ કરતું નથી; અથવા ફક્ત પ્રતિબંધિત પશુ અપૂર્ણાંકોને ધ્યાનમાં લો. માયકોબેક્ટેરિયા ડેટાસેટ, આ કાર્યમાં, કુલ 70 સ્ટ્રેન્સ છે, જે બધા ક્લોનલ સંકુલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જેનો ઉપયોગ પુનઃસંયોજન માટે સ્ક્રીન કરવા માટે થાય છે. ડેટા સેટને ચાર સંચિત સ્તરો અનુસાર માપવામાં આવે છે: (1) Eu2 સભ્યો, (2) બધા યુરોપિયન ક્લોન સંકુલ સભ્યો (એટલે ​​કે યુરોપ), (3) યુરોપિયન અને આફ્રિકન ક્લોન સંકુલ (Eu + Af) અને (4) સમગ્ર ડેટા સંગ્રહ (જેનોમ સહિત જે પહેલાથી વર્ણવેલ કોઈપણ ક્લોનિંગ સંકુલમાં શામેલ નથી).
આ પૂર્વધારણાનો વધુ અભ્યાસ કરવા માટે, જીનોમ વચ્ચે પુનઃસંયોજન ઘટનાઓની ગેરહાજરીનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે એક વિભાજીત-વિઘટન નેટવર્ક કરવામાં આવ્યું હતું, કારણ કે આ પદ્ધતિ વ્યક્તિઓ વચ્ચેના પૂર્વજોના સંબંધની કલ્પના કરી શકે છે અને વિરોધાભાસી ફાયલોજેનેટિક સંકેતો પ્રદર્શિત કરી શકે છે. વિશ્લેષણમાં ચારેય ડેટા સેટે નેટવર્કમાં લૂપ્સના અસ્તિત્વની પુષ્ટિ કરી હતી (એટલે ​​\u003d, એવા વિસ્તારો જે એક જ વૃક્ષમાં ભેગા થતા નથી), પરંતુ ફી પરીક્ષણમાં કોઈ આંકડાકીય સમર્થન નથી (Eu2, p = 0.0956; યુરોપ, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; સમગ્ર ડેટા સેટ p = 0.2451), જે પુનર્ગઠન ઘટનાઓના અસ્તિત્વ માટે નબળા પુરાવા પૂરા પાડે છે (આકૃતિ 3A-D).
યુરોપમાં 2 જીનોમ (n = 37) (A), યુરોપિયન જીનોમ (n = 44) (B), યુરોપિયન અને આફ્રિકન જીનોમ (n = 51) (C) અને સમગ્ર ડેટા સેટ (n = 70) (D).
આ વિશ્લેષણ પછી, અને બધા નેટવર્ક્સમાં ચક્રીય અવલોકનોને ધ્યાનમાં લેતા, ગુબિન્સ પાઇપલાઇનમાં અમલમાં મૂકાયેલ પુનર્નિર્માણ અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ ક્લોનલ વંશનું પુનર્નિર્માણ કરવા અને એમ. બોવિસ જીનોમ પર પુનર્સંયોજનની અસરના અંદાજને પૂરક બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. પુનર્સંયોજન ઘટનાઓની સંચિત સંખ્યાનું અનુમાન કરો, જેમાંથી મોટાભાગની ટર્મિનલ શાખાઓમાં (એટલે ​​\u200b\u200bકે, એક જ જીનોમમાં) બની હતી (કોષ્ટક 2). આ સૂચકાંકો સમગ્ર ડેટા સેટની સુસંગતતા દર્શાવે છે અને સૂચવે છે કે પુનર્સંયોજન ઘટનાઓની આવર્તન પરિવર્તન કરતા 200 થી 300 ગણી છે. એકવાર શાખા પર પુનર્સંયોજન અને બિંદુ પરિવર્તનના સંબંધિત દરનું પ્રતિનિધિત્વ કરતું rho/theta પરિમાણ 0.0037 અને 0.0056 (કોષ્ટક 3) ની વચ્ચે દેખાય છે. તાજેતરમાં, 38 M. બોવિસ સ્ટ્રેનના પ્રકાશિત કાર્યમાં આ ડેટાસેટમાં મેળવેલા મૂલ્ય કરતાં વધુ rho/theta મૂલ્ય (rho/theta = 0.1) દર્શાવવામાં આવ્યું હતું, પરંતુ પટાને અને તેમના સાથીદારોના કાર્યમાં પુનઃસંયોજન પરિમાણોનું અનુમાન કરવા માટે સંદર્ભ-આધારિત એસેમ્બલીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, એસેમ્બલી પ્રક્રિયાને કારણે પ્રક્રિયાગત વિગત, ટર્મિનલ શાખામાં પુટેટીવ પુનઃસંયોજન ઘટનાઓની વિપુલતા સાથે સંકળાયેલી છે.
આગળ, r/m પરિમાણ પુનઃસંયોજન અને પરિવર્તન પરિચયના વિવિધતા ગુણોત્તરનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને તેનું સરેરાશ મૂલ્ય 0.025 અને 0.037 ની વચ્ચે છે, જે દર્શાવે છે કે પરિવર્તનની તુલનામાં, પુનઃસંયોજન M. bovis (કોષ્ટક 3)) ની આનુવંશિક વિવિધતા પર ઓછી એકંદર અસર કરે છે. વ્યાપક સરખામણી માટે, 23 જીનોમથી બનેલા MTBC ડેટાસેટ માટે r/m પરિમાણનો અંદાજ કાઢવા માટે સમાન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જે સરેરાશ મૂલ્ય 0.48620 દર્શાવે છે, જ્યારે Patané અને સાથીદારોના 38 M. bovis ડેટાસેટ માટે, તે સાબિત થયું કે સરેરાશ મૂલ્ય 0.98 છે. પ્રથમ અભ્યાસમાં, M. bovis (M. bovis BCG અને સંદર્ભ તાણ) ના કાર્યમાં 23 જીનોમમાંથી ફક્ત બે જ શામેલ હતા, તેથી M. tuberculosis જીનોમના અતિશય અભિવ્યક્તિને કારણે પ્રાપ્ત મૂલ્ય પક્ષપાતી હોઈ શકે છે. બીજા અહેવાલમાં, વિશ્લેષિત માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ વસ્તી મુખ્યત્વે યુનાઇટેડ સ્ટેટ્સ અને પશુધન યજમાનમાંથી પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવી હતી. તેનાથી વિપરીત, અમારા ડેટા સેટમાં, વધુ ભૌગોલિક સ્થાનો અને યજમાન પ્રજાતિઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરવામાં આવે છે, અને વિવિધ વસ્તી આનુવંશિક લાક્ષણિકતાઓ સાથે વિવિધ ક્લોનલ સંકુલમાં જૂથબદ્ધ જીનોમનો પણ ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, આમ વધુ ઊંડા અને વ્યાપક વસ્તી જ્ઞાન પ્રાપ્ત થાય છે. અમારા ડેટા સેટ સાથે મેળવેલ તફાવત r/m સરેરાશ મૂલ્ય એ ખ્યાલ સાથે સુસંગત છે કે સમાન વર્ગીકરણ પ્રજાતિઓને સોંપેલ વંશ વચ્ચે પુનઃસંયોજનની ડિગ્રી ખૂબ જ બદલાય છે, તેથી આ પરિણામો સૂચવે છે કે M. bovis ક્લોન સંકુલ પુનઃસંયોજન તફાવતો પ્રદર્શિત કરી શકે છે. અસર પણ Didelot & Maiden72 દ્વારા સૂચવવામાં આવી છે. તેમ છતાં, મોટી સંખ્યામાં M. bovis જીનોમનો સમાવેશ કરીને આ ડેટા સેટને નોંધપાત્ર રીતે વિસ્તૃત કરવાથી આ મુદ્દાની વધુ સ્પષ્ટતા થશે. r/m અને rho/theta બંને પરિમાણો શાખાઓ વચ્ચે પરિવર્તનશીલતા દર્શાવે છે, અને આ પરિણામ અન્ય બેક્ટેરિયલ પ્રજાતિઓ પરના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે72,73.
છેલ્લે, ગુબિન્સ પાઇપલાઇન દ્વારા ઓળખાયેલી પુનર્ગઠન ઘટનાઓની પુષ્ટિ કરવા માટે, RDP4 સોફ્ટવેરમાં છ અલગ અલગ અલ્ગોરિધમ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો જેથી સ્વતંત્ર રીતે વિવિધ કોર મલ્ટી-કમ્પેરિસન્સનું પરીક્ષણ કરી શકાય. વૈશ્વિક સ્તરે, ગુબિન્સ દ્વારા ઓળખાયેલી અડધાથી ઓછી ઘટનાઓ RDP4 દ્વારા પુષ્ટિ મળી હતી (કોષ્ટકો 4 અને 5). સમગ્ર ડેટા સેટને ધ્યાનમાં લેતા, ત્રણ પુનઃસંયોજન ઘટનાઓની પુષ્ટિ થઈ હતી, જેમાં બે આંતરિક ગાંઠો સામેલ હતા અને બીજી ટર્મિનલ શાખામાં એક જ જીનોમ સામેલ હતી, જેના માટે ક્લોનલ સંકુલ સોંપી શકાતા ન હતા (કોષ્ટકો 4 અને 5). ટર્મિનલ શાખાઓમાં ઘટનાઓની ઓળખ સૂચવી શકે છે કે સમકાલીન M. bovis સ્ટ્રેન્સમાં પુનઃસંયોજન હજુ પણ પ્રગતિમાં છે અથવા પરિણામ ખોવાઈ ગયું છે70. આ કાલ્પનિક પુનઃસંયોજન ક્ષેત્રમાં, લગભગ 20% સ્થિતિઓમાં અવ્યાખ્યાયિત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (N) છે, આમ પુનઃસંયોજન સિગ્નલને અસર કરે છે (પૂરક આકૃતિ 2). વધુમાં, આ પ્રદેશ rrs જનીનને અસર કરે છે, જે 16S રિબોસોમલ RNA ને એન્કોડ કરે છે જે ખૂબ જ સંરક્ષિત હોવાની અપેક્ષા છે, તેથી આ પુટેટિવ ​​રિકોમ્બિનેશન સિગ્નલ સિક્વન્સિંગ ભૂલો અથવા ખોટી ગોઠવણીનું પરિણામ હોઈ શકે છે. પછી Mb0003 અને માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ AF2122/97 વચ્ચેનો સંપૂર્ણ જીનોમ સંરેખણ કરવામાં આવ્યો, અને અવ્યાખ્યાયિત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ અને SNPs ના અસ્તિત્વની પુષ્ટિ કરવામાં આવી, તેથી ખોટા સંરેખણને લગતી સંભવિત સમસ્યાઓ આ કાર્યમાં અમલમાં મુકાયેલી જૈવિક માહિતીને કારણે નહોતી પ્રોગ્રામ શીખ્યા પછી દેખાયા.
આંતરિક ગાંઠોના પુનઃસંયોજન ક્ષેત્રોમાં કોઈ ગાબડા કે અવ્યાખ્યાયિત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ મળ્યા નથી (આકૃતિઓ 4 અને 5). આ ઘટનાઓ અંગે, એકમાં ફક્ત Eu2 જીનોમ છે અને તે pks12 જનીનને અસર કરે છે, જે સંભવિત પોલીકેટાઇડ સિન્થેઝને એન્કોડ કરે છે; જ્યારે બીજો Eu1 જીનોમમાં નોંધાયેલ છે અને સંભવિત નાઈટ્રેટ રીડક્ટેઝને એન્કોડ કરતા narX જનીનને અસર કરે છે (કોષ્ટક 4). સામાન્ય રીતે, પુનઃસંયોજન વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે આંકડાકીય સમર્થન સાથે પુનઃસંયોજન ટુકડાઓની મર્યાદિત સંખ્યા છે, અને અનુમાનિત સૂચકાંકો સૂચવે છે કે પુનઃસંયોજનનો M. bovis વંશ પર ઓછો પ્રભાવ પડે છે. પુનઃસંયોજન સિગ્નલ ઓછો હોવાની અપેક્ષા છે, પરંતુ સાચા ઉત્ક્રાંતિ સિગ્નલને પૃષ્ઠભૂમિ અવાજથી અલગ પાડવું મહત્વપૂર્ણ છે, જે એક પડકારજનક કાર્ય છે. સંદર્ભ-આધારિત એસેમ્બલી અને મિસમેચ સમસ્યાઓ 70, 71 દ્વારા રજૂ કરાયેલા અવાજ સિગ્નલને ઘટાડવા માટે, સંપૂર્ણ જીનોમ સિવાય બાકીના બધાને શરૂઆતથી એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા, અને QUAST પાઇપલાઇન વિશ્લેષણ (પૂરક કોષ્ટક 1) દ્વારા એસેમ્બલી ગુણવત્તા તપાસવામાં આવી હતી અને ખાતરી કરવામાં આવી હતી. વધુમાં, એકંદર સર્વેક્ષણની મજબૂતાઈ અને ચોકસાઈ પૂરી પાડવા માટે પૂરક વિશ્લેષણોની શ્રેણી હાથ ધરવામાં આવી હતી. તેથી, માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ AF2122/97 સામે રીડ મેપિંગ દ્વારા narX અને pks12 જનીનોની ક્રમ ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. પદ્ધતિ વિભાગમાં ઉલ્લેખિત માપદંડો (ઓછામાં ઓછા 20 રીડિંગ્સ અને 0.9 ફેરફાર આવર્તન) લાગુ કરીને પુનઃસંયોજન ક્ષેત્રમાં ભલામણ કરેલ SNP સ્થિતિની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. બે જીનોમ (Mb1792361 અને Mb7240415; 2.3%) અને pks12 જીનોમ: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, અને Mb12 જનીનોમાં narX જનીનનું પોલીમોર્ફિઝમ સંપૂર્ણપણે પુષ્ટિ કરવામાં આવ્યું હતું. જોકે, જીનોમ Mb2043 માટે, આઠમાંથી છ સ્થિતિઓ રીડ ડેપ્થ માપદંડને પૂર્ણ કરતી નથી કારણ કે SNP મહત્તમ 17 રીડ દ્વારા સમર્થિત છે, જે 20 ના સ્થાપિત કટઓફ મૂલ્યથી નીચે છે. તેથી, આ જીનોમ સાઇટ પર છ જીનોમ (8.6%) ના પુનઃસંયોજનની પુષ્ટિ કરી શકાય છે (આકૃતિઓ 4 અને 5).
માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ ડેટાસેટના રિકોમ્બિનેશન રિજન એલાઈનમેન્ટનું વિગતવાર વિઝ્યુલાઇઝેશન, શક્ય નાઈટ્રેટ રીડક્ટેઝને એન્કોડ કરતા narX જનીનને અસર કરે છે. આંતરિક ગાંઠોના રિકોમ્બિનેશન રિજનમાં કોઈ ગેપ અથવા અવ્યાખ્યાયિત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ મળ્યા નથી. આ ચોક્કસ ઘટના Eu1 જીનોમમાં નોંધાયેલી છે. માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ AF2122/97 ના રીડનું પ્લોટિંગ કરીને narX જનીનની સિક્વન્સિંગ ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. પદ્ધતિ વિભાગમાં ઉલ્લેખિત માપદંડો (ઓછામાં ઓછા 20 રીડિંગ્સ અને 0.9 ફેરફાર આવર્તન) લાગુ કરીને રિકોમ્બિનેશન ક્ષેત્રમાં ભલામણ કરેલ SNP સ્થાનની પુષ્ટિ કરો. Mb1792361 અને Mb7240415 (2.3%) ના જીનોમમાં narX જનીનનું પોલીમોર્ફિઝમ સંપૂર્ણપણે પુષ્ટિ થયેલ હતું.
pks12 જનીનને અસર કરતા માયકોપ્લાઝ્મા બોવિસ ડેટાસેટના રિકોમ્બિનેશન રિજન એલાઈનમેન્ટનું વિગતવાર વિઝ્યુલાઇઝેશન. આંતરિક ગાંઠોના રિકોમ્બિનેશન રિજનમાં કોઈ ગેપ અથવા અવ્યાખ્યાયિત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ મળ્યા નથી. શક્ય પોલીકેટાઇડ સિન્થેઝને એન્કોડ કરતી pks12 જનીનને અસર કરતી ઘટના અંગે, તેમાં ફક્ત Eu2 જીનોમ છે. માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસ AF2122/97 ના રીડ મેપિંગ દ્વારા pks12 ની સિક્વન્સિંગ ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. પદ્ધતિ વિભાગમાં ઉલ્લેખિત માપદંડો (ઓછામાં ઓછા 20 રીડિંગ્સ અને 0.9 ફેરફાર આવર્તન) લાગુ કરીને રિકોમ્બિનેશન એરિયામાં ભલામણ કરેલ SNP સ્થાનની પુષ્ટિ કરો. Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 અને Mb1960 જીનોમના પોલીમોર્ફિઝમ્સની સંપૂર્ણ પુષ્ટિ કરવામાં આવી છે.
PE અને PPE જનીનોમાં પુનરાવર્તિત પ્રદેશો હોય છે જે ઇલુમિના સિક્વન્સિંગ અને મિસમેપિંગ દ્વારા સરળતાથી ખોટી રીતે વાંચવામાં આવે છે, તેથી તેઓ સામાન્ય રીતે મેપિંગ-ટુ-સિક્વન્સ વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરતી વખતે જ M. ટ્યુબરક્યુલોસિસ સભ્યોના બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ વર્કફ્લોમાંથી કાઢી નાખવામાં આવે છે. આ કાર્યમાં લાગુ કરાયેલ પુનઃસંયોજન ઘટનાઓનો અનુમાન PE/PPE ફિલ્ટર કર્યા વિના ડી નોવો એસેમ્બલી પર આધારિત છે. અમારું માનવું છે કે SplitsTree, Gubbins પાઇપલાઇન અને RDP4 સોફ્ટવેર દ્વારા ત્રણ અલગ અલગ પૂરક પદ્ધતિઓ અને અલ્ગોરિધમ્સ લાગુ કરીને, લાગુ કરાયેલ વ્યૂહરચનાઓ ભૂલ સંકેતોને કારણે થતા પુનર્ગઠિત પ્રદેશોને પ્રક્રિયા અને ફિલ્ટર કરવા માટે મજબૂત છે. જો કે, SNP ક્લસ્ટરોને ઓળખવા માટે Gubbins અને RDP4 સોફ્ટવેર પર PE/PPE જનીનની દખલગીરીને બાકાત રાખવા માટે, અને તેથી narX અને pks12 જનીનોને અસર કરવા માટે પ્રસ્તાવિત પુનઃસંયોજન પ્રદેશોની ઓળખ માટે, આ જનીનોના પડોશની તપાસ કરવામાં આવી હતી (પૂરક આકૃતિ 3-5). M. bovis AF2122/97 માં, narX જનીન narK2 અને Mb1764c દ્વારા અલગ પડે છે, જ્યારે pks12 Mb2075c અને Mb2073c દ્વારા ઘેરાયેલું છે (પૂરક આકૃતિ 3-5). સંપૂર્ણ જીનોમના MAUVE સિંક્રનાઇઝેશન નકશાનો ઉપયોગ કરીને જનરેટ કરાયેલ નકશો જનીન ક્રમ સંરક્ષણ અને પુનર્ગઠન વિશે માહિતી પ્રદાન કરે છે, જેમાં ચાર કોલિનિયર બ્લોક્સ અને જીનોમ ટ્રાન્સલોકેશન અથવા વ્યુત્ક્રમના કોઈ ચિહ્નો નથી. વધુમાં, એમિનો એસિડ ક્રમ સાથે પૂરક વિશ્લેષણે બધા સંપૂર્ણ જીનોમમાં હોમોલોજી સાબિત કરી, અને narX અથવા pks12 ના નજીકના પ્રદેશોમાં કોઈ PE/PPE મળ્યું નથી. narX માટે, એક જીનોમ (Mb0030) નો સમાનાર્થી સ્કોર ઓછો છે કારણ કે narX જનીનને બે ટુકડાઓ (ટુકડાઓ 1891 અને 1890) તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું હતું. pks12 માટે, સમાનતાને કારણે, Mb0030 અને Mb003 એ ઓછા સિનલાઇનરિટી સ્કોર્સ દર્શાવ્યા, જ્યારે pks12 ને અનુક્રમે બે અને ત્રણ ટુકડાઓમાં ઓળખવામાં આવ્યું, જે પ્રોટીનના વિવિધ ડોમેનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે (પૂરક આકૃતિ 3-5). આ માહિતીને ધ્યાનમાં લેતા, અને ગુબિન્સ અને RDP4 સોફ્ટવેર બંને વિશ્લેષણ કરે છે, વિન્ડોમાં મહત્તમ 500 bp ના કોર મલ્ટિપલ એલાઇનમેન્ટ તપાસે છે, અમે પુષ્ટિ કરી છે કે PE/PPE જનીન narX અને pks12 ને અસર કરતા રિકોમ્બિનેશન સિગ્નલમાં દખલ કરશે નહીં.
આ ડેટા સેટમાં શોધાયેલા પુનઃસંયોજન સંકેતોને અવશેષ ગણી શકાય, પરંતુ એ વાત સાચી છે કે એમ. બોવિસમાં પુનઃસંયોજનની શક્યતા નકારી શકાય નહીં, તેથી તે વધુ વિશ્લેષણનો વિષય બનવું જોઈએ, જેમાં વિવિધ રોગચાળાના દૃશ્યોમાંથી સંપૂર્ણ જીનોમને મહત્વપૂર્ણ ક્રમમાં ગોઠવવામાં આવે છે.
પુનઃસંયોજન સુધારણા પહેલા અને પછી મેળવેલા ML ફાયલોજેનેટિક વૃક્ષોની સરખામણી કરવાથી (આકૃતિ 2A, B) અનુમાનિત ફાયલોજેનેટિક સંબંધમાં નોંધપાત્ર ફેરફારો થયા ન હતા, અને M. bovis જાતો સમાન જૂથમાં ક્લસ્ટર કરવામાં આવી હતી.
M. bovis AF2122/97 ના સંદર્ભ જીનોમ સાથે 42 નવા ક્રમબદ્ધ M. bovis રીડ્સનું મેપિંગ કર્યા પછી, 1816 પોલીમોર્ફિક પોઝિશન ધરાવતું SNP સંરેખણ પ્રાપ્ત થયું. મોટાભાગના SNP (87.1%) કોડિંગ ક્ષેત્રમાં સ્થિત છે, અને અસરગ્રસ્ત જનીનો બોવિલિસ્ટ (આકૃતિ 6A, B) માં દર્શાવેલ કાર્યાત્મક શ્રેણીઓ અનુસાર વર્ગીકૃત થયેલ છે. દરેક કાર્યાત્મક શ્રેણીમાં જનીનોની કુલ સંખ્યાને ધ્યાનમાં લેતા, "લિપિડ મેટાબોલિઝમ" શ્રેણીમાં જનીનોએ વધુ SNP દર્શાવ્યા, ત્યારબાદ "કોષ દિવાલ અને કોષ પ્રક્રિયાઓ" અને "મધ્યવર્તી ચયાપચય અને શ્વસન", જે દર્શાવે છે કે તેઓ M. bovis ઉત્ક્રાંતિમાં છે.
પોર્ટુગલના એમ. બોવિસ ડેટાસેટનું હાયરાર્કિકલ વિશ્લેષણ (n = 42). દરેક કાર્યાત્મક શ્રેણી (A) માટે નોંધાયેલા SNP અને અસરગ્રસ્ત જનીનોની કુલ સંખ્યા. કાર્ય શ્રેણી (B) દ્વારા નોંધાયેલા સમાનાર્થી અને બિન-સમાનાર્થી ફેરફારોની કુલ સંખ્યા.
વૈશ્વિક સ્તરે, સરેરાશ dN/dS ગુણોત્તર 1.5 કરતા વધુ સારો છે, જે દર્શાવે છે કે વૈશ્વિક ઉત્ક્રાંતિ દબાણ પૂર્વજોની સ્થિતિથી છુટકારો મેળવવાનું છે અને તે સકારાત્મક (વૈવિધ્યસભર અથવા નિર્દેશિત) અને/અથવા હળવા શુદ્ધિકરણ પસંદગી દૃશ્યનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. "વાયરુલન્સ, ડિટોક્સિફિકેશન, અનુકૂલન", "નિવેશ ક્રમ અને તબક્કાઓ", અને "નિયમનકારી પ્રોટીન" ની શ્રેણીઓમાં, બે તૃતીયાંશ કરતાં વધુ SNP બિન-સમાનાર્થી છે (આકૃતિ 6B).
બધી શ્રેણીઓમાં, બહુવિધ SNPs ધરાવતા જનીનો હોય છે, જેના પરિણામે સરેરાશ પરિવર્તન દર (એટલે ​​કે, પ્રતિ જનીન સરેરાશ SNP) 1 કરતા વધારે હોય છે (આકૃતિ 6A). 15 SNPs સાથે Pks12 (Mb2074c) અને 8 SNPs સાથે fas (Mb2553c) માં પરિવર્તન મૂલ્યો વધુ હોય છે. આ બંને જનીનો ફેટી એસિડ ચયાપચયમાં સામેલ છે. pks જનીન પોલીકેટાઇડ સિન્થેઝ (PKS) ને એન્કોડ કરે છે, જે માયકોબેક્ટેરિયલ કોષ દિવાલ લિપિડ બાયોસિન્થેસિસ74,75 માં સામેલ એક મલ્ટિફંક્શનલ એન્ઝાઇમ છે. આ જનીન એક મલ્ટિફંક્શનલ પોલીપેપ્ટાઇડને એન્કોડ કરે છે જે માયકોકેટાઇડ્સ74,76 ના સંશ્લેષણમાં સામેલ છે. ફાસ જનીન માયકોલિક એસિડના સંશ્લેષણમાં સામેલ છે. આ બંને જનીનો યજમાનના સંપર્કમાં કોષ દિવાલના બાયોસિન્થેસિસમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે.
માયકોબેક્ટેરિયમ બોવિસના ઉત્ક્રાંતિનો વધુ અભ્યાસ કરવા માટે, ચોક્કસ જનીનોના બે સેટનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. અગાઉ પ્રકાશિત થયેલા કાર્યોમાં ક્રમ રચના અને ફાયલોજેનેટિક પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને એવા જનીનો ઓળખવામાં આવ્યા હતા જે MTBC પૂર્વજો દ્વારા વૈવિધ્યકરણ પહેલાં HGT દ્વારા પ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યા હતા37,38. આ જનીનો પૂરક કોષ્ટક 2 માં સૂચિબદ્ધ છે. HGT સાથે સંબંધિત હોઈ શકે તેવા કુલ 77 જનીનોના SNP વિતરણનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને 26 પોલીમોર્ફિક સાઇટ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જે મોટાભાગના કિસ્સાઓમાં (78%) બિન-સમાનાર્થી (NS) ફેરફારોમાં પરિણમ્યા હતા (પૂરક કોષ્ટક 2). MTBC જીનોમ પરના અગાઉના કાર્યમાં દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે પુટેટિવ ​​HGT પ્રદેશ બાકીના જીનોમની તુલનામાં ઉચ્ચ NS SNP ગુણોત્તર દર્શાવે છે. જો કોઈ એવું વિચારે છે કે આ પુનઃસંયોજન પ્રદેશો MTBC પૂર્વજો દ્વારા પ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યા હતા, અને તેથી, તેઓ પ્રાચીન બહુરૂપતાઓને વધારે રજૂ કરે છે, તો સમાનાર્થી ફેરફારોનું પ્રમાણ વધુ હોવાની અપેક્ષા છે, કારણ કે NS અવેજીઓ નકારાત્મક પસંદગી દ્વારા દૂર થવાની અપેક્ષા છે કારણ કે એમિનો એસિડ ફેરફારો પ્રોટીનના કાર્યને બદલી શકે છે. તેથી, અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે કાર્યાત્મક પરિણામો HGT જેવા જનીનોના સ્થાનાંતરણથી ઉદ્ભવી શકે છે, જે મૂલ્યવાન અનુકૂલનશીલ આનુવંશિક વિવિધતા માટે તેમના મહત્વને પ્રતિબિંબિત કરે છે.
આ વિશ્લેષણની સમાંતર, 3R (DNA રિપેર, રેપ્લિકેશન અને રિકોમ્બિનેશન) સિસ્ટમના ઘટકોને એન્કોડ કરતા જનીનોની સંપૂર્ણ તપાસ ડોસ વલ્ટોસ અને સહયોગીઓ (2008)39 દ્વારા અગાઉ પ્રકાશિત સૂચિ અનુસાર કરવામાં આવી હતી. સમાન DNA ટુકડાઓનું વિનિમય સીધી રીતે અવલોકન કરી શકાતું નથી, જોકે જ્યારે નજીકથી સંબંધિત બેક્ટેરિયા સામેલ હોય ત્યારે તે વારંવાર થતી પ્રક્રિયા હોઈ શકે છે, જેમ કે આ ડેટા સેટના કિસ્સામાં; વધુમાં, આ પ્રક્રિયા DNA રિપેર પદ્ધતિઓ72 ની ચાવી હોઈ શકે છે, તેથી હોમોલોગસ રિકોમ્બિનેશનમાં ભૂમિકા ભજવે છે. 54 જનીનો દ્વારા વિતરિત કુલ 26 પોલીમોર્ફિક સ્થિતિઓ ઓળખવામાં આવી હતી (પૂરક કોષ્ટક 3). જનીનોના આ સમૂહમાં, NS ફેરફારો પરિણામોના લગભગ 65% માટે જવાબદાર હતા, જે માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ સ્ટ્રેન્સ પરના અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે.