Ви благодариме што ја посетивте Nature. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите понова верзија на прелистувачот (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во исто време, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе прикажуваме страници без стилови и JavaScript.
Секвенционирањето на геномот го ревитализираше полето на истражување на заразни болести, откривајќи ја епидемиологијата на болестите, патогенезата, интеракциите домаќин-патоген и еволутивниот процес наметнат на патогените. Комплексот Mycobacterium tuberculosis (MTBC) го смета Mycobacterium bovis за еден од неговите животински адаптивни членови кои предизвикуваат туберкулоза (TB) кај копнените цицачи и е типичен модел на бактериска еволуција. Како и другите членови на MTBC, се претпоставува дека Mycobacterium bovis е строго клониран, бавно еволуирачки патоген и очигледно нема знаци на рекомбинација или хоризонтален трансфер на гени. Во оваа работа, применуваме компаративна геномика на збир на податоци за секвенца на целиот геном (WGS) составен од 70 говеда M. од различни родослови (Европа и Африка) за да добиеме увид во генетската разновидност на говедата M. Еволутивна моќ. Се користат три различни методи за проценка на знаците на реорганизација. Глобално, мал број на настани на рекомбинација се идентификувани и потврдени со два независни методи со солидна поддршка. Сепак, во споредба со мутациите, рекомбинацијата има послаб ефект врз разновидноста на M. bovis (вкупен r/m = 0,037). Разликата во просекот r/m добиен во клоналниот комплекс на Mycobacterium bovis во нашиот збир на податоци е во согласност со општиот концепт дека степенот на рекомбинација може значително да варира помеѓу лозите доделени на истиот таксономски вид. Врз основа на оваа работа, рекомбинацијата кај Mycobacterium bovis не може да се исклучи, па затоа треба да биде предмет на понатамошни напори во идните компаративни геномски истражувања, во кои WGS на големи збирови на податоци од различни епидемиолошки сценарија низ целиот свет е клучна. Потоа беше извршена дополнителна анализа на помалиот збир на податоци за Mycobacterium bovis (n = 42) од преваленцата на туберкулоза кај повеќе домаќини, и беа идентификувани повеќе од 1.800 локуси, од кои барем еден сој покажа полиморфизам на еден нуклеотид (SNP). Повеќето (87,1%) се наоѓаат во кодирачкиот регион, а глобалниот сооднос на несинонимни промени (dN/dS) на синонимни промени надминува 1,5, што укажува дека позитивната селекција е важна еволутивна сила што се врши врз M. bovis. Поголем дел од SNPs е откриен во гени богати со функционални категории на „липиден метаболизам“, „клеточен ѕид и клеточни процеси“ и „среден метаболизам и дишење“, откривајќи го нивниот потенцијал во биологијата и еволуцијата на важноста на Mycobacterium bovis. Подетален поглед на гените кај предците на MTBC кои се склони кон хоризонтален трансфер на гени и вклучени во системот 3R (поправка на ДНК, репликација и рекомбинација) ја открива глобалната просечна негативна вредност на D неутралниот тест на Таиџима, што укажува на минато селективно скенирање. Неодамнешното тесно грло по експанзијата на популацијата е сè уште главниот еволутивен фактор за задолжителниот патоген Mycobacterium bovis да се бори против домаќинот.
Комплексот Mycobacterium tuberculosis (MTBC) е еден од најуспешните таксони на бактериски патогени и типичен случај на бактериска еволуција. Неговите членови покажуваат изненадувачки висок нуклеотиден идентитет на геномско ниво (> 99%)1,2. Различни MTBC екотипови можат да предизвикаат туберкулоза (TB), која е заразна грануломатозна болест, кај широк спектар на видови домаќини, од микроцицачи до луѓе3,4,5. Во моментов, комплексот вклучува луѓе [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] и патогени прилагодени на животни (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" и "dassie")5,6. M. canettii (исто така познат како „Nodobacter glabrata“) Просечниот нуклеотиден идентитет со гореспоменатите микобактерии е 98%, а компаративната геномска работа покажа дека M. canettii и остатокот од MTBC неодамна се одвоиле од заедничкиот предок.7 Имајќи го предвид овој концепт, некои автори го нарекуваат M. canettii член на MTBC 8.
MTBC е систематски опишан како строг клонален комплекс, а неговата структура на популацијата е јасно регулирана со намалена разновидност, тесни грла, селективно скенирање и генетски дрифт9,10. Претпоставувајќи дека комплексната строга клонална еволуција, како што се недостасувачките полиморфизми, не може да се обнови со рекомбинација. Врз основа на оваа премиса, последователните настани на геномското бришење на диференцијалниот регион (RD) и TbD1 (регион за специфична бришење на Mtb 1) се предложени како молекуларни маркери на еволуцијата на MTBC2,5,11. Компаративната геномика и работата за секвенционирање на целиот геном (WGS) ја поддржуваат поделбата на членовите прилагодени на луѓето во девет лози (Mycobacterium tuberculosis L1 до L4, L7 и L8; и Mycobacterium africanum L5, L6 и L9), лозите L2 до L4 со делено бришење на TbD1 регионот2,11,12,13. Дополнително, се претпоставува дека членовите адаптирани на животни делат заеднички предок, кој е дефиниран со специфични за кладовите делеции во RD7, RD8, RD9 и RD102, 5 и 14.
Хоризонталниот генски трансфер (HGT) и настаните на рекомбинација се сметаат за ретки и се јавуваат кај предците на MTBC, наместо различната историја на целиот член на MTBC15,16,17. Два рани извештаи од Хјуз и соработниците (2002) и Гутакер и соработниците (2006) сугерираа дека настаните на рекомбинација може да помогнат во обликувањето на полиморфизмите што означуваат специфични локуси кај соевите на M. tuberculosis18,19. Причините за очигледниот недостаток на рекомбинација во MTBC се: (1) механичкиот процес и губењето на способноста на HGT; (2) реткоста на настаните на HGT; (3) нема шанси за настани на рекомбинација во нишата на MTBC14,17. Неодамна, некои студии за секвенционирање на целиот геном (WGS) применети на сојот MTBC 20 и Mycobacterium bovis 21 дадоа докази за рекомбинација, првите што покажуваат дека соевите MTBC често разменуваат мали фрагменти на ДНК, но поради ограничената варијација на нуклеотидната секвенца, овие настани сè уште не се забележуваат.
Mycobacterium bovis е најчесто пронајдениот член на MTBC од добиток (главно говеда), иако може да се изолира и од диви животни кои се движат на слободен оддалеченост и оградени животни4,22,23,24. M. bovis еволуирал во пет главни клонални комплекси [Европски 1 (Eu1), Европски 2 (Eu2), Европски 3 (Eu3), Африкански 1 (Af1) и Африка 2 (Af2)], според профилот на сполиготипизирање, специфичните делеции и полиморфизмите на единечни нуклеотиди (SNPs)25, 26, 27, 28, 29 во специфични гени. Овие клонални комплекси ја демонстрираат разновидната структура на популацијата на Mycobacterium bovis и нејзината поврзаност со географските региони. Покрај тоа, неодамнешната WGS работа спроведена од Зимпел и соработниците (2020) дизајнираше филогенија базирана на SNP на Mycobacterium bovis, со повеќе од 1.900 геноми, што укажува дека постојат најмалку четири различни лози (именувани од Lb1 до Lb1 до Lb4), тие не се целосно во согласност со претходно дефинираниот клонален комплекс, иако може да се потврди и географска специфичност30. Овие автори извршија диференцијална анализа на филогенијата и молекуларното датирање, но не ја проучуваа рекомбинацијата30.
Претходните истражувања со користење на различни молекуларни техники, како што се сполиготипизација, MIRU-VNTR (број на повторувања со интерпретирани единици и варијабилни тандемски повторувања на микобактерии) и неодамнешното типизирање на SNP открија одредено ниво на генетска разновидност меѓу соевите на M. bovis 31,32,33, 34,35. Диференцијацијата на генетската варијација стана важна алатка во проучувањето на епидемиологијата на болести, што е корисно за длабинско разбирање на патогенезата, вирулентноста и преносот на болести. Појавата на методот WGS дава можност да се откријат еволутивните фактори наметнати од геномот на Mycobacterium bovis во процесот на адаптација и перзистенција на различни домаќини и епидемиолошки сценарија.
Во оваа работа, користиме компаративна геномска анализа на различни податочни групи на Mycoplasma bovis (n = 70), вклучувајќи изолати од различни клонални комплекси, за да добиеме увид во еволутивниот процес на Mycoplasma bovis, особено за да ги решиме филогенетските врски и настаните на рекомбинација. Како додаток на оваа анализа, под-податоци од изолати на M. bovis (n = 42) добиени од добро карактеризирана област со повеќе домаќини на туберкулоза во Португалија 31,36 беа дополнително истражени за да се заклучи дека не се идентитетни. Рамнотежата помеѓу релативниот однос на сенс (dN) и синонимните (dS) нуклеотидни супституции, како и еволутивниот придонес на специфични геноми споменати во литературата, тие се 37,38 добиени од предци на MTBC преку HGT и кодираат генски компоненти на 3R (поправка, репликација и рекомбинација на ДНК) систем 39. Изберете гени добиени преку HGT бидејќи тие можат да претставуваат древни полиморфизми, па затоа се очекува дека тие можат да содржат поголем дел од синонимни промени. Гените вклучени во 3R системот беа избрани бидејќи претходната работа на соеви на M. tuberculosis покажа општи негативни/прочистувачки селекции кои делуваат на овие гени, а тие можат да играат важна улога во еволуцијата 39. Друга цел на оваа работа е да се заклучи постоењето на настани за реорганизација. Поради оваа причина, имајќи предвид дека нашиот збир на податоци од Португалија ги содржи само геномите на европскиот клонски комплекс 2 и соевите на кои не им е доделен клонскиот комплекс, решивме да вклучиме јавно достапни податоци за геномот за конечно да добиеме претставник на сите клонски комплекси и да ја подобриме робусноста и ширината на резултатите.
42 новосеквенционирани геноми на Mycoplasma bovis од португалската ендемска сцена на туберкулоза со повеќе домаќини (детали подолу), претходно карактеризирани од епидемиолошка перспектива36, се во центарот на оваа работа. Со оглед на тоа што збирот на податоци од Португалија има претставници само на европските 2 клонови комплекси и соеви без назначени комплекси, додадени се јавно достапни податоци за секвенционирање на целиот геном за да се прошири збирот на податоци што ги вклучува сите претставници на клоновите комплекси на M. bovis. Затоа, во оваа работа беа користени три извори на податоци за секвенционирање на целиот геном: целосно/нацрт склопување на геном, до 10 скелиња складирани во NCBI (Национален центар за биотехнолошки информации) (n = 15 изолати); складирани во SRA (датотеката Illumina fastq од архивата за читање секвенци) ја претставува комплексната разновидност на клоновите на M. bovis (n = 12 изолати)30; и 42 новосеквенционирани геноми од Португалија. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) беше исклучен од пребарувањето на NCBI. M. bovis AF2122/97 обично се користи како референтен геном што треба да се вклучи во базата на податоци. Поради јавната недостапност на целата геномска секвенца претставена од клонирачкиот комплекс African 1 и малиот број геноми од репрезентативните соеви на Af2 и Eu1, во овие случаи беа користени оригиналните податоци за секвенционирање обезбедени од SRA. Работата на Зимпел и неговите соработници (2020) помогна да се идентификува геномот од гореспоменатиот клонирачки комплекс и помогна во изборот на Mycobacterium bovis за вклучување во базата на податоци. За Eu3 е опишан само еден тип на геном (Branger et al., 2020), па затоа геномот што го вклучуваме е посебен претставник на комплексот Eu3.
Глобално, овој збир на податоци вклучува 70 говеда M. bovis изолирани од 8 видови домаќини, дистрибуирани во 12 земји од 1985 до 2016 година. 36 видови се означени како Eu2, 7 видови се Eu1, 1 вид е Eu3, 3 видови се Af1, 4 видови се Af2 и 19 не се припишуваат на никаков клонален комплекс (детали подолу). Деталните информации (вклучувајќи го и пристапниот број) за Mycobacterium bovis што се користат во оваа студија се прикажани во Табела 1 и Дополнителна Табела 1.
42 новосеквенционирани цели геноми на Mycobacterium bovis од жариштата на туберкулоза кај животните во Португалија и дистрибуирани повеќе од 12 години се во центарот на оваа студија, бидејќи потенцијалните системи за болести меѓу дивите животни и добитокот редовно се следат 31,36 (Дополнителна слика 1). Според последователните процедури, овие соеви беа изолирани од говеда (n = 14), елен (n = 16) и дива свиња (n = 12) од 2003 до 2015 година: собирајте ги и ракувајте со животните во согласност со препорачаните протоколни упатства. Примероците од ткиво се во Прирачникот за копнени животни на OIE и се инокулираат на цврста и течна подлога од пируват Stonebrink и Löwenstein-Jensen. Културите се инкубираат на 37 °C, а растот се проверува еднаш неделно најмалку 12 недели. Колониите се складираат директно во раствор од глицерол на -80ºC. Во селективниот медиум Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), оригиналните архивирани примероци беа пропуштени низ еден in vitro пасаж in vitro за да се добие ДНК од програмата WGS. За таа цел, замрзнатиот раствор на културата беше збогатен со 5% натриум пируват и 10% ADS (50 g албумин, 20 g гликоза, 8,5 g натриум хлорид во 1 L вода) на Middlebrook 7H9 на 37°C Retrain. По 4 недели раст, медиумот беше обновен и културата редовно се следеше сè додека не се забележи раст. Клетките беа собрани со центрифугирање, пелетот беше ресуспендиран во 500 µL фосфатен пуферски солен раствор (PBS), загреан на 99 °C 30 минути, центрифугиран, а супернатантот беше складиран на -20 °C до WGS. Сите процедури се спроведуваат во објекти за биолошка безбедност од ниво 3.
Библиотеката на геном со парни краеви на WGS е подготвена со користење на уникатниот индекс на секој примерок на ДНК и користи технологија Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 примероци) и HiSeq (2 × 150 pb) (два изолати) (Eurofins Genomics, Германија) за секвенционирање. Според упатствата на производителот, користете го Illumina Genome Analyzer со двоен додаток на модулот за секвенционирање на геномската ДНК и користете го Nextera XT DNA Library Prep Kit од Illumina за да ја конструирате библиотеката.
Земајќи ги предвид податоците добиени од SRA (n = 12), идентификацијата на клонскиот комплекс може да се користи како метаподатоци на соодветната публикација 30, 41, 43. Кога се разгледува комплетниот геном, освен за Mycobacterium bovis AF2122/97 и Mycobacterium bovis 3601, кои се признати членови на клонскиот комплекс Eu1 и Eu3 25, 29, соодветно, тој е ист како и комплетниот геном на Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI пристапен број NC_000962.3). Усогласувањето на геномот се врши со користење на MAFFT (програма за повеќекратно усогласување на аминокиселинска или нуклеотидна секвенца, верзија 7.458) и параметарот -addfragments48. Потоа, се пребарува отсуство на различни клонски комплекси и/или присуство на SNP карактеристики.
Новосеквенционираниот Mycobacterium bovis (n = 42) и оригиналните отчитувања на склопениот нацрт на геномот (n = 3) го усогласуваат комплексот со референтниот геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv преку vSNP цевководот и присуството на карактеристики на делеција и/или SNP кај различни клонови. Беше спроведено пребарување.
Соберете информации од недостатокот на карактеристики и/или присуството/отсуството на SNP и профили за сполиготипизирање за да доделите геномски податоци на соодветниот клонален комплекс. За четирите нацрт-склопови, профилот за сполиготипизирање не може да се заклучи, па затоа тие се вклучени во групата „без сложеност“.
Работниот тек на биоинформатиката што го следи оваа работа започнува од de novo склопување и мапирање до референтна стратегија, со цел да се истражат настаните на рекомбинација и специфичните полиморфизми на геномот. Слика 1 дава дијаграм на тек на чекорите што се следат. За анализа на рекомбинација, сите геноми се користат за да се зголеми робусноста на заклучоците и поврзаните индикатори.
За да ги намалиме грешките при генерирањето на консензусни секвенци на геномот, прво добивме de novo склопување, а потоа добивме повеќекратни порамнувања на јадрото. Протокот Unicycler моментално е достапен на https://github.com/rrwick/Unicycler49 и се користи за извршување de novo склопување на 54 секвенционирани геноми (42 новосеквенционирани и 12 fastq датотеки обновени од SRA). Накратко, пред склопувањето од нула, анализата на квалитетот на читањето беше извршена во FastQC верзија 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) и Trimmomatic верзија 0.36 (се применуваат опциите „сечење адаптери и други секвенци специфични за осветлување од читања“ и „Исечете бази од крајот на читањето, ако квалитетот е понизок од граничниот квалитет од 20“) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Потоа, SPAdes optimizer49 беше користен за склопување на геномот, а Pilon верзија 1.1851 беше користен за оптимизација по склопувањето. За да се избегне неправилно склопување, беше избран конзервативен режим на премостување, а големината на k-mer беше пребарана и избрана помеѓу 20% и 95% од должината на читање. Следете ги упатствата на SPAdes и земете ја предвид големината на читање, избришете ги контизите помали од 300 bp и воспоставете гранична вредност на покриеност од 20 длабочина на читање од 52. Во стратегијата за de novo склопување, геномските региони како што се паралогите на пролин-глутамат (PE) и пролин-пролин глутамат (PPE) не беа отстранети.
Квалитетот на de novo склопувањето се проценува преку QUAST цевководот (http://quast.sourceforge.net/quast.html), што го олеснува обновувањето на контигот и мапирањето на референтниот геном на M. bovis AF2122/97 (NCBI пристапен број LT708304.1) (видете ја Дополнителната Табела 1 за параметрите за квалитет).
Со помош на vSNP цевководот (https://github.com/USDA-VS/vSNP), FASTQ датотеката на новосеквенционираниот M. bovis од секвенционирањето на Illumina се споредува со референтниот геном на M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Според препораките за најдобра пракса на Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, се применуваат стандардни параметри на филтерот или варијантни масени резултати за рекалибрација. Резултатите се филтрираат со користење на најнискиот масен резултат на SAMtools од 150 и AC = 2. Исто така, користете го Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) за да ги проверите отчитувањата за да се исклучи контаминација. vSNP цевководот што се користи за мапирање на стратегиите за секвенционирање во нашата работа испитува серија дефинирани SNP и цели, а исто така исклучува и мешани сценарија за инфекција. Покриеноста на прочитаниот геном е подобра од 99% (Дополнителна табела 1).
За да се избегнат грешки при мапирање и погрешни SNP, филтрирајте ја варијантата во следниве случаи: (1) е поткрепена со помалку од 20 отчитувања, (2) се наоѓа со фреквенција помала од 0,9, (3) е во барем еден сој, но барем има празнини во друг сој. Интегрираниот прегледувач на геномика (IGV) верзија 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 беше користен за визуелна верификација на SNP и позиции со проблеми со мапирање или усогласување. Бидејќи гените пролин-глутамат (PE) и пролин-пролин глутамат (PPE) се многу дуплирани и се дел од повеќегенско семејство, тие лесно се погрешно разбрани од секвенционирањето и погрешното мапирање на Illumina, па затоа се претпочитаат. Работниот тек на микобактериската биоинформатика ги отстрани членовите на туберкулозниот комплекс при користење на стратегијата на мапирање за секвенционирање за да се потврдат SNP. Затоа, ги филтриравме PE/PPE гените и инделите од анализата.
Според Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), сите SNP се поделени во функционални категории. SnpEff цевководот (https://pcingola.github.io/SnpEff/) се користи за да се заклучат последиците од SNP (синонимни или несинонимни промени). Создадена е нова база на податоци за геномот на Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Повеќекратното усогласување на основниот геном беше извршено со користење на Parsnp v1.2, моментално достапен на https://github.com/marbl/parsnp57, користејќи 69 комплетни геноми/нацрт-склопови (со опција -c) и M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) е користен како референца. Извршени се четири повеќекратни усогласувања на основните елементи: само членовите на комплексот за клонирање Eu2 (n = 37), вклучувајќи ги сите членови на европскиот комплекс за клонирање (n = 44), вклучувајќи ја и точката на спојување на европскиот и африканскиот комплекс за клонирање (n = 51), и вклучувајќи ги сите Mycobacterium bovis во оваа студија (n = 70).
Усогласувањето на јадрото генерирано од Parsnp се користи за да се изведе филогенетското дрво со максимална веројатност (ML) користејќи го CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 користејќи RAxML и да се извршат 1000 водени репликации.
За паралелна проверка на присуството на настани на рекомбинација се користат три различни алгоритми и биоинформатички алатки: софтверот SplitsTree4, софтверот Gubbins (непристрасна лоза преку рекомбинација во нуклеотидни секвенци) и софтверот RDP4 (програма за детекција на рекомбинација, бета верзија 4.101).
Методот на разделување на расцепување имплементиран во SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 се користи за пресметување на филогенетската мрежа без корен, користејќи Phi тест за статистичка верификација, а прагот на значајност е p = 0,05. Основната анализа на повеќекратно порамнување на Parsnp се користи како влез, а се реализира разделувањето на расцепување како мрежен стандард.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) работи со стандардни параметри како друг начин за евалуација на влијанието на рекомбинацијата врз Mycobacterium bovis. Алгоритмот имплементиран во pipeline ја реконструира релевантната клонска лоза. Целосниот геном/нацрт склоп на нашиот сет на податоци и референтниот геном (говедско говедо AF2122/97, LT708304.1) се меѓусебно поврзани; и ја скенираат позицијата на SNP на секоја гранка од дрвото за да го детектираат SNP кластерот што го претставува настанот на рекомбинација. Нулата на гранката. Претпоставете дека нема настан на рекомбинација, што значи дека SNP што се јавуваат на гранката треба да бидат рамномерно распределени. Повеќекратното порамнување на јадрото од Parsnp и најдобро оценетото ML дрво од RAxML се користат како влезни датотеки.
Конечно, за да се потврди настанот за реорганизација предложен од цевководот Губинс, шесте алгоритми имплементирани во RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 и SiScan66) се применуваат на повеќекратното порамнување на јадрото на Parsnp под стандардните поставки. Утврдивме дека најмалку три од алгоритмите имплементирани во RDP4 мора постојано да демонстрираат важен сигнал за да се потврди секој настан на рекомбинација.
Со оглед на тоа што и софтверот Gubbins и RDP бараат сигнали за рекомбинација со проверка на повеќекратните подредувања на јадрото во прозорец до 500 bp и потврдувајќи дека вклучувањето на PE/PPE гените за време на de novo склопувањето нема да се меша со пронајдените сигнали за рекомбинација, понатамошна анализа се прави со хомолинеарност. Проверка на близината на генот што го идентификува настанот на рекомбинација. Синлинеарната мапа со користење на целиот геном е конструирана со користење на MAUVE-мулти-геномско подредување (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) за да се исклучат локалните транслокации или инверзии на геномот. Покрај тоа, целиот геном е користен за извршување на анализа на хомолинеарност на аминокиселинската секвенца преку веб-серверот SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Подетална анализа на множеството податоци за геномот добиени од португалскиот систем за туберкулоза со повеќе домаќини е да се провери полиморфизмот на гените споменати во литературата. Овие гени се 37,38 и генот што кодира 3R добиен од предците на MTBC преку компонентите на HGT (поправка, репликација и рекомбинација на ДНК) системот 39. Користете ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) и користете DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) за да ја пресметате разновидноста на гените и разновидноста на нуклеотидите (π) и внесениот параметар за неутрален тест D на Tajima.
Добиено е филогенетско дрво со максимална веројатност (ML) базирано на 69 изолати и референтни геноми на Mycoplasma bovis (Слика 2А). Во споредба со дрвјата базирани на еден ген или дрвјата базирани на повеќе локуси, оваа стратегија овозможува генерирање на помоќни дрвја кои не ја опфаќаат варијабилноста на целиот геном и затоа покажуваат помала способност за разликување помеѓу видовите 68,69. Тополошката структура на ML дрвото обично е во согласност со комплексната класификација на клоновите. Геномот на Eu2 е групиран во гранка, а геномот на Af1 е исто така групиран заедно (Слика 2А). Резултатот е исто така во согласност со познатата еволутивна врска на Mycobacterium bovis, односно постои голема разлика помеѓу членот Eu1 и групата што се состои од сите други клонални комплекси и геноми, но клонскиот комплекс 30 не е специфициран. Малата недоследност помеѓу клонскиот комплекс и односот забележан на филогенетското дрво може да се објасни со фактот дека клонскиот комплекс е опишан врз основа на специфични геномски региони, додека филогенетското дрво се базира на повеќекратни подредувања на јадрените геноми што го претставуваат целиот геном.
Филогенетското дрво со максимална веројатност (GTR) е конструирано врз основа на усогласувањето на основниот геном на геномот на Mycobacterium bovis пред (A) и по (B) отстранувањето на местото на рекомбинација. Боите на гранките го претставуваат комплексот на клонови на Mycobacterium bovis: Европа 1 е виолетова, Европа 2 е црвена, Европа 3 е сина, Африка 1 е портокалова и Африка 2 е зелена. Дрвото е вкоренето и нацртано во размер, а должината на гранката се мери како замена за секое место.
Комплексот Mycobacterium tuberculosis е опишан како клонално еволуиран, а повеќето докази акумулирани во текот на годините ја поддржуваат идејата дека тековните HGT и рекомбинациските настани нема да се појават на детектибилното ниво на MTBC15,17,18.
Претходните трудови покажаа дека може да има ограничена рекомбинација помеѓу соевите на MTBC20,21, додека други не успеаја да идентификуваат мерливи настани на рекомбинација70,71. Повторно дискутирајте го ова прашање со фокус на Mycobacterium bovis, што е различно од претходната работа во која се разгледуваше само Mycobacterium tuberculosis70,71; или разгледајте го MTBC како целина, речиси без M. bovis што претставува20; или земете предвид само рестриктивни фракции од говеда. Во збирката податоци за микобактерии, во оваа работа, има вкупно 70 соеви, кои ги претставуваат сите клонални комплекси, што се користат за скрининг за рекомбинација. Збирката податоци е скалирана според четири кумулативни нивоа: (1) членови на Eu2, (2) сите членови на европскиот клонски комплекс (т.е. Европа), (3) европски и африкански клонски комплекс (Eu + Af) и (4) целата збирка на податоци (вклучувајќи геноми кои не се вклучени во веќе опишаните клонирачки комплекси).
За понатамошно проучување на оваа хипотеза, беше извршена мрежа со разделена декомпозиција за да се процени отсуството на настани на рекомбинација помеѓу геномите, бидејќи овој метод може да ја визуелизира врската меѓу предците помеѓу единките и да прикаже спротивставени филогенетски сигнали. Сите четири сета податоци во анализата го потврдија постоењето на јамки во мрежата (т.е. области кои не се спојуваат во едно дрво), но Phi тестот нема статистичка поддршка (Eu2, p = 0,0956; Европа, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; целиот сет на податоци p = 0,2451), што дава слаби докази за постоењето на настани на реорганизација (Слика 3A-D).
Во Европа 2 геноми (n = 37) (A), европски геноми (n = 44) (B), европски и африкански геноми (n = 51) (C) и целиот збир на податоци (n = 70) (D).
По оваа анализа, и земајќи ги предвид цикличните набљудувања во сите мрежи, алгоритмот за реконструкција имплементиран во цевководот на Губинс беше применет за реконструкција на клонската лоза и за дополнување на проценката на ефектот од рекомбинацијата врз геномот на M. bovis. Заклучете го кумулативниот број на настани на рекомбинација, од кои повеќето се случиле во терминалните гранки (т.е. во еден геном) (Табела 2). Овие индикатори ја покажуваат конзистентноста на целиот збир на податоци и укажуваат дека фреквенцијата на настаните на рекомбинација е 200 до 300 пати поголема од фреквенцијата на мутациите. Откако параметарот rho/theta што ги претставува релативните стапки на рекомбинација и точкести мутации на гранката, се чини дека е помеѓу 0,0037 и 0,0056 (Табела 3). Неодамна, објавената работа за сојот M. bovis од 38 покажа повисока вредност rho/theta (rho/theta = 0,1) од онаа добиена во овој збир на податоци, но работата на Патане и неговите колеги користеше склопување базирано на референци за да ги заклучи параметрите на рекомбинација. Процедурален детаљ, поради постапката на склопување, е поврзан со изобилството на претпоставени настани на рекомбинација во терминалната гранка.
Потоа, параметарот r/m го претставува односот на разновидност на рекомбинација и воведување на мутации, а неговата просечна вредност е помеѓу 0,025 и 0,037, што укажува дека во споредба со мутациите, рекомбинацијата има помало целокупно влијание врз генетската разновидност на M. bovis (Табела 3). За опширна споредба, сличен метод беше користен за проценка на параметарот r/m за множеството податоци MTBC составено од 23 геноми, покажувајќи просечна вредност од 0,48620, додека за множеството податоци на Patané и неговите колеги од 38 за M. bovis, се покажа дека просечната вредност е 0,98. Во првата студија, само два од 23-те геноми вклучени во работата на M. bovis (M. bovis BCG и референтниот сој), така што добиената вредност може да биде пристрасна поради прекумерната експресија на геномот на M. tuberculosis. Во вториот извештај, анализираните популации на Mycobacterium bovis беа главно извлечени од Соединетите Американски Држави и домаќини на добиток. Спротивно на тоа, во нашиот збир на податоци, претставени се повеќе географски локации и видови домаќини, а се користат и геноми групирани во различни клонални комплекси со различни популациски генетски карактеристики, со што се постигнува подлабоко и пошироко познавање на популацијата. Просечната вредност на разликата r/m добиена со нашиот збир на податоци е во согласност со концептот дека степенот на рекомбинација варира значително помеѓу лозите доделени на истиот таксономски вид, па затоа овие резултати укажуваат дека комплексот на клонови на M. bovis може да покаже разлики во рекомбинацијата. Влијанието е исто како што сугерираат Didelot & Maiden72. Сепак, значителното проширување на овој збир на податоци со вклучување на поголем број геноми на M. bovis ќе овозможи дополнително разјаснување на оваа точка. И параметрите r/m и rho/theta покажуваат варијабилност помеѓу гранките, а овој резултат е во согласност со извештаите за други бактериски видови72,73.
Конечно, за да се потврдат настаните за реорганизација идентификувани од протоколот на Губинс, во софтверот RDP4 беа користени шест различни алгоритми за независно тестирање на различни основни мулти-споредби. Глобално, помалку од половина од настаните идентификувани од Губинс беа потврдени од RDP4 (Табели 4 и 5). Земајќи го предвид целиот збир на податоци, беа потврдени три настани на рекомбинација, два кои вклучуваат внатрешни јазли, а другиот вклучува еден геном во терминална гранка, за која не можеа да се доделат клонални комплекси (Табели 4 и 5). Идентификацијата на настаните во терминалните гранки може да укаже дека рекомбинацијата е сè уште во тек кај современите соеви на M. bovis или резултатот е погрешно поставен70. Во овој хипотетички регион на рекомбинација, приближно 20% од позициите имаат недефинирани нуклеотиди (N), со што влијаат на сигналот за рекомбинација (Дополнителна слика 2). Дополнително, овој регион влијае на rrs генот, кодирајќи ја 16S рибозомската РНК за која се очекува да биде високо конзервирана, па затоа овој претпоставен сигнал за рекомбинација може да биде резултат на грешки во секвенционирањето или несоодветно усогласување. Потоа беше извршено целосно усогласување на геномот помеѓу Mb0003 и Mycobacterium bovis AF2122/97, и беше потврдено постоењето на недефинирани нуклеотиди и SNP, па затоа можните проблеми поврзани со погрешното усогласување не се должеа на биолошките информации имплементирани во оваа работа. Се појави по учењето на програмата.
Не се пронајдени празнини или недефинирани нуклеотиди во рекомбинациските региони на внатрешните јазли (Слики 4 и 5). Во однос на овие настани, едниот го содржи само геномот Eu2 и влијае на генот pks12, кој кодира можна поликетид синтаза; додека другиот е регистриран во геномот Eu1 и влијае на генот narX кој кодира можна нитрат редуктаза (Табела 4). Општо земено, анализата на рекомбинацијата покажува дека постои ограничен број на рекомбинациски фрагменти со статистичка поддршка, а изведените индикатори укажуваат дека рекомбинацијата има мало влијание врз лозата M. bovis. Се очекува сигналот на рекомбинација да биде низок, но важно е да се разликува вистинскиот сигнал за еволуција од позадинскиот шум, што е предизвикувачка задача. Со цел да се намали сигналот на шум воведен со проблеми со склопување и несовпаѓање базирано на референца 70, 71, сите останати освен целиот геном беа склопени од нула, а квалитетот на склопувањето беше проверен и обезбеден со анализа на QUAST цевковод (Дополнителна табела 1). Дополнително, беше спроведена серија дополнителни анализи за да се обезбеди робусноста и точноста на целокупното истражување. Затоа, квалитетот на секвенционирањето на гените narX и pks12 беше оценет со мапирање на читање наспроти Mycobacterium bovis AF2122/97. Препорачаната позиција на SNP во рекомбинацискиот регион беше потврдена со примена на критериумите споменати во делот за методот (најмалку 20 отчитувања и фреквенција на промени од 0,9%). Полиморфизмот на генот narX беше целосно потврден во двата генома (Mb1792361 и Mb7240415; 2,3%) и геномите на геномот pks12: гените Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 и Mb12. Сепак, за геномот Mb2043, шест од осумте позиции не го исполнуваат критериумот за длабочина на читање бидејќи SNP е поддржан од максимум 17 читања, што е под утврдената гранична вредност од 20. Затоа, може да се потврди рекомбинацијата на шест геноми (8,6%) на ова место на геномот (Слики 4 и 5).
Деталната визуелизација на усогласувањето на рекомбинацискиот регион на базата на податоци на Mycobacterium bovis влијае на генот narX кој кодира можна нитрат редуктаза. Не се пронајдени празнини или недефинирани нуклеотиди во рекомбинацискиот регион на внатрешните јазли. Овој конкретен настан е регистриран во геномот Eu1. Квалитетот на секвенционирањето на генот narX беше оценет со прикажување на отчитувањата на Mycobacterium bovis AF2122/97. Потврдете ја препорачаната локација на SNP во областа на рекомбинација со примена на критериумите споменати во делот за методот (најмалку 20 отчитувања и фреквенција на промени од 0,9%). Полиморфизмот на генот narX беше целосно потврден во геномите на Mb1792361 и Mb7240415 (2,3%).
Детална визуелизација на усогласувањето на рекомбинацискиот регион на базата на податоци на Mycoplasma bovis што влијае на генот pks12. Не се пронајдени празнини или недефинирани нуклеотиди во рекомбинацискиот регион на внатрешните јазли. Во однос на настанот што влијае на генот pks12 што кодира можна поликетид синтаза, тој го содржи само геномот Eu2. Квалитетот на секвенционирањето на pks12 беше оценет со мапирање на читање на Mycobacterium bovis AF2122/97. Потврдете ја препорачаната локација на SNP во областа на рекомбинација со примена на критериумите споменати во делот за методот (најмалку 20 отчитувања и фреквенција на промени од 0,9). Полиморфизмите на геномите Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 и Mb1960 се целосно потврдени.
Гените PE и PPE имаат повторувачки региони кои лесно се погрешно читаат со секвенционирање и погрешно мапирање на Illumina, па затоа тие обично се бришат од биоинформатичкиот работен тек на членовите на M. tuberculosis само кога се користи стратегијата за мапирање во секвенца. Заклучокот за настаните на рекомбинација применети во оваа работа се базира на de novo склопување без филтрирање на PE/PPE. Веруваме дека со имплементација на три различни комплементарни методи и алгоритми преку SplitsTree, Gubbins pipeline и RDP4 софтверот, применетите стратегии се робусни за обработка и филтрирање на реорганизираните региони предизвикани од сигнали за грешка. Сепак, за да се исклучи мешањето на генот PE/PPE врз софтверот Gubbins и RDP4 за да се идентификуваат SNP кластерите, а со тоа и идентификацијата на регионите на рекомбинација за кои се претпоставува дека влијаат на гените narX и pks12, беше испитано соседството на овие гени (Дополнителна слика 3-5). Кај M. bovis AF2122/97, генот narX е одделен од narK2 и Mb1764c, додека pks12 е опкружен со Mb2075c e Mb2073c (Дополнителна слика 3-5). Мапата генерирана со користење на MAUVE синлинската мапа на целиот геном дава информации за зачувување и преуредување на генската секвенца, покажувајќи четири колинеарни блокови и без знаци на транслокација или инверзија на геномот. Покрај тоа, анализата на комплементација со аминокиселинската секвенца ја докажа хомологијата во сите комплетни геноми и не е пронајден PE/PPE во соседните региони на narX или pks12. За narX, еден геном (Mb0030) има помал резултат за синонимија бидејќи генот narX е идентификуван како два фрагменти (фрагменти 1891 и 1890). За pks12, поради сличности, Mb0030 и Mb003 покажаа пониски резултати за синлинеарност, додека pks12 беше идентификуван во два и три фрагменти, соодветно, што претставуваат различни домени на протеинот (Дополнителна слика 3-5). Земајќи ги предвид овие информации, а софтверите Gubbins и RDP4 извршија анализа, проверете го повеќекратното порамнување на јадрото од максималните 500 bp во прозорецот, потврдивме дека генот PE/PPE нема да се меша со сигналот за рекомбинација што влијае на narX и pks12.
Иако сигналите за рекомбинација откриени во овој збир на податоци може да се сметаат за резидуални, точно е дека рекомбинацијата кај M. bovis не може да се исклучи, па затоа треба да продолжи да биде предмет на понатамошна анализа, во која цели геноми од различни епидемиолошки сценарија се секвенционираат до важни.
Споредувањето на филогенетските дрвја на ML добиени пред и по корекцијата на рекомбинацијата (Слика 2А, Б) не доведе до значајни промени во заклучениот филогенетски однос, а соевите на M. bovis беа групирани во истата група.
По мапирањето на 42 новосеквенционирани читања на M. bovis со референтниот геном на M. bovis AF2122/97, добиено е SNP усогласување кое содржи 1816 полиморфни позиции. Повеќето SNP (87,1%) се наоѓаат во кодирачкиот регион, а засегнатите гени се карактеризираат според функционалните категории прикажани во Bovilist (Слика 6A, B). Земајќи го предвид вкупниот број на гени во секоја функционална категорија, гените во категоријата „липиден метаболизам“ покажаа повеќе SNP, проследени со „клеточен ѕид и клеточни процеси“ и „среден метаболизам и респирација“, откривајќи дека се во еволуција на M. bovis.
Хиерархиска анализа на базата на податоци за M. bovis од Португалија (n = 42). Вкупен број на регистрирани SNP и засегнати гени за секоја функционална категорија (A). Вкупен број на синонимни и несинонимни промени регистрирани по функционална категорија (B).
На глобално ниво, просечниот однос dN/dS е подобар од 1,5, што укажува дека глобалниот еволутивен притисок е да се ослободиме од состојбата на предците и претставува позитивен (диверзифициран или насочен) и/или опуштен сценарио за избор на прочистување. Во категориите „вирулентност, детоксикација, адаптација“, „инсерциски секвенци и фаги“ и „регулаторни протеини“, повеќе од две третини од SNP се несинонимни (Слика 6Б).
Во сите категории, постојат гени со повеќекратни SNP, што резултира со просечна стапка на мутации (односно, просечниот SNP по ген) поголема од 1 (Слика 6А). Pks12 (Mb2074c) со 15 SNP и fas (Mb2553c) со 8 SNP имаат повисоки вредности на мутации. И двата гена се вклучени во метаболизмот на масните киселини. Генот pks кодира поликетид синтаза (PKS), кој е мултифункционален ензим вклучен во биосинтезата на липидите на клеточниот ѕид на микобактериите74,75. Овој ген кодира мултифункционален полипептид кој е вклучен во синтезата на микокетиди74,76. Генот fas е вклучен во синтезата на миколна киселина. И двата гена играат важна улога во биосинтезата на клеточниот ѕид во контакт со домаќинот.
Со цел понатамошно проучување на еволуцијата на Mycobacterium bovis, беа анализирани два сета специфични гени. Претходно објавени трудови со користење на состав на секвенца и филогенетски методи идентификуваа гени кои биле стекнати од предците на MTBC преку HGT пред диверзификацијата37,38. Овие гени се наведени во Дополнителната табела 2. Анализирана е дистрибуцијата на SNP од вкупно 77 гени кои можат да бидат поврзани со HGT и идентификувани се 26 полиморфни места, кои во повеќето случаи (78%) резултирале со несинонимни (NS) промени (Дополнителна табела 2). Претходната работа на MTBC геномот покажа дека претпоставениот HGT регион покажува повисок сооднос на NS SNP во споредба со остатокот од геномот. Ако се помисли дека овие региони на рекомбинација биле стекнати од предците на MTBC и затоа тие премногу ги претставуваат античките полиморфизми, тогаш се очекува процентот на синонимни промени да биде поголем, бидејќи се очекува супституциите на NS да бидат елиминирани со негативна селекција поради промените на аминокиселините кои можат да ја променат функцијата на протеинот. Затоа, нашите резултати укажуваат дека функционалните последици може да произлезат од замената на гените слични на HGT, што ја одразува нивната важност за вредната адаптивна генетска разновидност.
Паралелно со оваа анализа, гените што ги кодираат компонентите на системот 3R (поправка, репликација и рекомбинација на ДНК) беа темелно испитани во согласност со листата претходно објавена од дос Вултос и соработниците (2008)39. Размената на идентични фрагменти од ДНК не може директно да се набљудува, иако може да биде чест процес кога се вклучени тесно поврзани бактерии, како во случајот со овој збир на податоци; покрај тоа, овој процес може да биде клучен за методите за поправка на ДНК72, па затоа играат улога во хомологната рекомбинација. Идентификувани се вкупно 26 полиморфни позиции дистрибуирани од 54 гени (Дополнителна табела 3). Во овој збир на гени, промените во NS учествуваа со околу 65% од последиците, што е во согласност со претходните извештаи за соеви на Mycobacterium tuberculosis.
Време на објавување: 21 октомври 2021 година