Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot jaunāku pārlūkprogrammas versiju (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Vienlaikus, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs rādīsim vietnes bez stiliem un JavaScript.
Genoma sekvencēšana ir atdzīvinājusi infekcijas slimību pētījumu jomu, atklājot slimību epidemioloģiju, patogenēzi, saimnieka un patogēna mijiedarbību un patogēniem noteikto evolūcijas procesu. Mycobacterium tuberculosis komplekss (MTBC) uzskata Mycobacterium bovis par vienu no saviem dzīvnieku adaptīvajiem locekļiem, kas izraisa tuberkulozi (TB) sauszemes zīdītājiem, un tas ir tipisks baktēriju evolūcijas modelis. Tāpat kā citi MTBC locekļi, Mycobacterium bovis tiek uzskatīts par stingri klonētu, lēni evolūcijas patogēnu, un acīmredzami nav nekādu rekombinācijas vai horizontālas gēnu pārneses pazīmju. Šajā darbā mēs izmantojam salīdzinošo genomiku visam genoma sekvences (WGS) datu kopumam, kas sastāv no 70 liellopu M. no dažādām ciltsrakstiem (Eiropas un Āfrikas), lai iegūtu ieskatu liellopu M. ģenētiskajā daudzveidībā. Evolūcijas spēks. Reorganizācijas pazīmju novērtēšanai tiek izmantotas trīs dažādas metodes. Globāli ir identificēts neliels skaits rekombinācijas gadījumu un apstiprināts ar divām neatkarīgām metodēm ar stabilu pamatojumu. Tomēr, salīdzinot ar mutācijām, rekombinācijai ir vājāka ietekme uz M. bovis daudzveidību (kopējais r/m = 0,037). Mūsu datu kopā iegūtā Mycobacterium bovis klonālā kompleksa r/m vidējā starpība atbilst vispārējai koncepcijai, ka rekombinācijas pakāpe var ievērojami atšķirties starp līnijām, kas piešķirtas vienai un tai pašai taksonomiskajai sugai. Pamatojoties uz šo darbu, rekombināciju Mycobacterium bovis nevar izslēgt, tāpēc tai vajadzētu būt turpmāku centienu objektam salīdzinošās genomikas pētījumos, kuros izšķiroša nozīme ir lielu datu kopu VGS no dažādiem epidemioloģiskiem scenārijiem visā pasaulē. Pēc tam tika veikta papildu analīze ar mazāku Mycobacterium bovis datu kopu (n = 42) no daudzu saimnieku tuberkulozes izplatības, un tika identificēti vairāk nekā 1800 lokusi, no kuriem vismaz vienam celmam bija viena nukleotīda polimorfisms (SNP). Lielākā daļa (87,1%) atrodas kodējošajā reģionā, un sinonīmo izmaiņu globālā nesinonīmo izmaiņu attiecība (dN/dS) pārsniedz 1,5, kas norāda, ka pozitīvā selekcija ir svarīgs evolūcijas spēks, kas iedarbojas uz M. bovis. Lielāka SNP proporcija tika konstatēta gēnos, kas bagāti ar funkcionālajām kategorijām "lipīdu metabolisms", "šūnu sieniņa un šūnu procesi" un "starpposma metabolisms un elpošana", atklājot to potenciālu Mycobacterium bovis bioloģijā un evolūcijā. Rūpīgāk aplūkojot MTBC senču gēnus, kas ir pakļauti horizontālai gēnu pārnešanai un iekļauti 3R (DNS atjaunošanas, replikācijas un rekombinācijas) sistēmā, atklājas Taidžimas D neitrālā testa globālā vidējā negatīvā vērtība, kas norāda uz iepriekšējo selektīvo skenēšanu. Nesenā sašaurinājuma situācija pēc populācijas palielināšanās joprojām ir galvenais evolūcijas virzītājspēks, kas veicina obligātā patogēna Mycobacterium bovis cīņu ar saimnieku.
Mycobacterium tuberculosis komplekss (MTBC) ir viena no veiksmīgākajām baktēriju patogēnu taksonām un tipisks baktēriju evolūcijas gadījums. Tās pārstāvji uzrāda pārsteidzoši augstu nukleotīdu identitāti genoma līmenī (> 99%)1,2. Dažādi MTBC ekotipi var izraisīt tuberkulozi (TB), kas ir infekcioza granulomatoza slimība, plašā saimnieku sugu klāstā, sākot no mikrozīdītājiem līdz cilvēkiem3,4,5. Pašlaik kompleksā ietilpst cilvēki [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] un dzīvniekiem adaptēti patogēni (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" un "dassie")5,6. M. canettii (pazīstama arī kā "Nodobacter glabrata") vidējā nukleotīdu identitāte ar iepriekšminētajām mikobaktērijām ir 98%, un salīdzinošās genomikas pētījumi ir parādījuši, ka M. canettii un pārējā MTBC nesen ir atšķīrušās no kopīgā senča.7 Ņemot vērā šo koncepciju, daži autori M. canettii sauc par MTBC 8. locekli.
MTBC sistemātiski tiek aprakstīts kā stingrs klonāls komplekss, un tā populācijas struktūru nepārprotami nosaka samazināta daudzveidība, vājās vietas, selektīva skenēšana un ģenētiskā novirze9,10. Pieņemot, ka sarežģītu stingru klonālu evolūciju, piemēram, trūkstošos polimorfismus, nevar atjaunot ar rekombināciju. Pamatojoties uz šo pieņēmumu, diferenciālā reģiona (RD) un TbD1 (Mtb specifiskā 1. delēcijas reģiona) genoma delēcijas secīgie notikumi ir ierosināti kā MTBC evolūcijas molekulārie marķieri2,5,11. Salīdzinošās genomikas un visa genoma sekvencēšanas (WGS) darbs apstiprina cilvēkiem adaptēto locekļu iedalījumu deviņās līnijās (Mycobacterium tuberculosis L1 līdz L4, L7 un L8; un Mycobacterium africanum L5, L6 un L9), līnijām L2 līdz L4 ir kopīga TbD1 delēcijas reģiona delēcija2,11,12,13. Turklāt tiek ierosināts, ka dzīvniekiem adaptētajiem locekļiem ir kopīgs sencis, ko nosaka kladei specifiskas delēcijas RD7, RD8, RD9 un RD102, 5 un 14.
Horizontālā gēnu pārnese (HGT) un rekombinācijas notikumi tiek uzskatīti par retiem un notiek MTBC senčos, nevis visa MTBC locekļa atšķirīgā vēsture15,16,17. Divos agrīnos Hjūza un līdzstrādnieku (2002) un Gutakera un līdzstrādnieku (2006) ziņojumos tika norādīts, ka rekombinācijas notikumi var palīdzēt veidot polimorfismus, kas iezīmē specifiskus lokusus M. tuberculosis celmos18,19. Acīmredzamā rekombinācijas trūkuma iemesli MTBC ir: (1) HGT mehāniskais process un spēju zudums; (2) HGT notikumu retums; (3) rekombinācijas notikumu iespējamība MTBC nišā nav14,17. Nesen daži pilna genoma sekvencēšanas (WGS) pētījumi, kas piemēroti MTBC celmam 20 un Mycobacterium bovis 21, ir snieguši pierādījumus par rekombināciju, kas ir pirmie, kas parāda, ka MTBC celmi bieži apmainās ar nelieliem DNS fragmentiem, taču ierobežotās nukleotīdu secības variācijas dēļ šie notikumi joprojām nav pamanīti.
Mycobacterium bovis ir visbiežāk no mājlopiem (galvenokārt liellopiem) atklātais MTBC loceklis, lai gan to var izolēt arī no brīvās turēšanas un iežogotos savvaļas dzīvniekiem4,22,23,24. M. bovis attīstījās piecos galvenajos klonu kompleksos [Eiropas 1 (Eu1), Eiropas 2 (Eu2), Eiropas 3 (Eu3), Āfrikas 1 (Af1) un Āfrikas 2 (Af2)] atbilstoši spoligotipa profilam, specifiskām delēcijām un viena nukleotīda polimorfismiem (SNP)25, 26, 27, 28, 29 specifiskos gēnos. Šie klonu kompleksi demonstrē Mycobacterium bovis populācijas daudzveidīgo struktūru un tās saistību ar ģeogrāfiskajiem reģioniem. Turklāt nesenajā Zimpela un līdzstrādnieku (2020) veiktajā WGS darbā tika izstrādāta filoģenēze, kuras pamatā ir Mycobacterium bovis SNP, ar vairāk nekā 1900 genomiem, kas norāda, ka pastāv vismaz četras dažādas līnijas (no Lb1 līdz Lb1 līdz Lb4), tās pilnībā neatbilst iepriekš definētajam klonālajam kompleksam, lai gan var apstiprināt arī ģeogrāfisko specifiku30. Šie autori veica filoģenēzes diferenciālanalīzi un molekulāro datēšanu, bet nepētīja rekombināciju30.
Iepriekšējie darbi, izmantojot dažādas molekulārās metodes, piemēram, spoligotipa noteikšanu, MIRU-VNTR (mikobaktēriju savstarpēji interspersed repeat unit-variable tandem repeat number – mainīgais tandēma atkārtojumu skaits) un nesen veikto SNP tipizēšanu, atklāja zināmu ģenētiskās daudzveidības līmeni starp M. bovis celmiem [31,32,33, 34,35]. Ģenētiskās variācijas diferenciācija ir kļuvusi par svarīgu instrumentu slimību epidemioloģijas pētījumos, kas palīdz padziļināti izprast patogenēzi, virulenci un slimību pārnešanu. VGS metodes parādīšanās sniedz iespēju atklāt evolūcijas virzītājspēkus, ko Mycobacterium bovis genoms nosaka adaptācijas un noturības procesā dažādiem saimniekiem un epidemioloģiskiem scenārijiem.
Šajā darbā mēs izmantojam salīdzinošu genomisko analīzi, izmantojot dažādus Mycoplasma bovis datu kopumus (n = 70), tostarp izolātus no dažādiem klonāliem kompleksiem, lai iegūtu ieskatu Mycoplasma bovis evolūcijas procesā, īpaši, lai atrisinātu filoģenētiskās attiecības un rekombinācijas notikumus. Kā papildinājums šai analīzei tika tālāk pētīts M. bovis izolātu apakšdatu kopums (n = 42), kas iegūts no labi raksturota daudzsaimnieku tuberkulozes apgabala Portugālē31,36, lai secinātu par neidentitātes līdzsvaru starp sensa (dN) un sinonīma (dS) nukleotīdu aizvietojumu relatīvo attiecību, kā arī literatūrā minēto specifisko genomu evolūcijas ieguldījumu, tos 37,38 ieguvuši MTBC senči, izmantojot HGT, un tie kodē 3R (DNS atjaunošanas, replikācijas un rekombinācijas) sistēmas gēnu komponentus 39. Izvēlieties gēnus, kas iegūti, izmantojot HGT, jo tie var pārstāvēt senus polimorfismus, tāpēc ir sagaidāms, ka tie var saturēt lielāku sinonīmu izmaiņu īpatsvaru. 3R sistēmā iekļautie gēni tika atlasīti, jo iepriekšējais darbs ar M. tuberculosis celmiem norādīja uz vispārējām negatīvām/attīrīšanas atlasēm, kas darbojas ar šiem gēniem, un tām var būt svarīga loma evolūcijā39. Vēl viens šī darba mērķis ir secināt reorganizācijas notikumu esamību. Šī iemesla dēļ, ņemot vērā, ka mūsu datu kopa no Portugāles satur tikai Eiropas klona kompleksa 2 genomus un celmus, kuriem klona komplekss nav piešķirts, mēs nolēmām iekļaut publiski pieejamus genoma datus, lai beidzot iegūtu visu klona kompleksu pārstāvniecību un uzlabotu rezultātu robustumu un plašumu.
Šī darba centrā ir 42 jauni sekvencēti Mycoplasma bovis genomi no Portugāles endēmiskās daudzsaimnieku tuberkulozes ainas (sīkāka informācija zemāk), kas iepriekš raksturoti no epidemioloģiskā viedokļa36. Ņemot vērā, ka datu kopā no Portugāles ir tikai Eiropas 2 klonu kompleksu pārstāvji un celmi bez apzīmētiem kompleksiem, ir pievienoti publiski pieejami pilna genoma sekvencēšanas dati, lai paplašinātu datu kopu, kas ietver visus M. bovis klonu kompleksu pārstāvjus. Tāpēc šajā darbā tika izmantoti trīs pilna genoma sekvencēšanas datu avoti: pilnīgs/melnraksta genoma salikšana, līdz 10 sastatnēm, kas glabājas NCBI (Nacionālais biotehnoloģijas informācijas centrs) (n = 15 izolāti); glabājas SRA (Illumina fastq fails sekvenču nolasīšanas arhīvā), kas attēlo M. bovis klonu komplekso daudzveidību (n = 12 izolāti)30; un 42 jauni sekvencēti genomi no Portugāles. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) tika izslēgts no NCBI meklēšanas. M. bovis AF2122/97 parasti tiek izmantots kā atsauces genoms, kas jāiekļauj datu kopā. Tā kā publiski nav pieejama visa genoma secība, ko pārstāv African 1 klonēšanas komplekss, un ir maz genomu no Af2 un Eu1 reprezentatīvajiem celmiem, šajos gadījumos tika izmantoti SRA sniegtie sākotnējie sekvencēšanas dati. Zimpela un viņa līdzstrādnieku darbs (2020) palīdzēja identificēt genomu no iepriekš minētā klonēšanas kompleksa un palīdzēja atlasīt Mycobacterium bovis iekļaušanai datu kopā. Eu3 gadījumā ir aprakstīts tikai viens genoma veids (Branger et al., 2020), tāpēc mūsu iekļautais genoms ir atsevišķs Eu3 kompleksa pārstāvis.
Kopumā šajā datu kopā ir iekļauti 70 liellopu M. bovis paraugi, kas izolēti no 8 saimnieku sugām, kuras no 1985. līdz 2016. gadam tika izplatītas 12 valstīs. 36 sugas ir apzīmētas kā Eu2, 7 sugas ir Eu1, 1 suga ir Eu3, 3 sugas ir Af1, 4 sugas ir Af2 un 19 sugas nav attiecināmas ne uz vienu klonu kompleksu (sīkāka informācija zemāk). Detalizēta informācija (tostarp piekļuves numurs) par Mycobacterium bovis, kas izmantota šajā pētījumā, ir parādīta 1. tabulā un 1. papildtabulā.
Šī pētījuma centrā ir 42 jauni sekvencēti Mycobacterium bovis veseli genomi no Portugāles dzīvnieku tuberkulozes perēkļiem, kas izplatīti vairāk nekā 12 gadus, jo potenciālās savvaļas dzīvnieku un mājlopu slimību sistēmas ir regulāri uzraudzītas31,36 (1. papildattēls). Saskaņā ar turpmākajām procedūrām šie celmi tika izolēti no liellopiem (n = 14), staltbriežiem (n = 16) un mežacūkām (n = 12) no 2003. līdz 2015. gadam: savākt un apstrādāt dzīvniekus saskaņā ar ieteiktajām protokola vadlīnijām. Audu paraugi ir atrodami OIE Sauszemes dzīvnieku rokasgrāmatā un ir inokulēti Stonebrink un Löwenstein-Jensen piruvāta cietajā barotnē un šķidrajā barotnē. Kultūras tiek inkubētas 37 °C temperatūrā, un augšanu pārbauda reizi nedēļā vismaz 12 nedēļas. Kolonijas tiek uzglabātas tieši glicerīna šķīdumā -80 °C temperatūrā. Mycobacterium selektīvajā vidē (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) sākotnējie arhivētie paraugi tika izvadīti caur vienu in vitro pāreju, lai iegūtu WGS programmas DNS. Šim nolūkam saldētās kultūras krājuma šķīdums tika bagātināts ar 5% nātrija piruvāta un 10% ADS (50 g albumīna, 20 g glikozes, 8,5 g nātrija hlorīda 1 l ūdens) uz Middlebrook 7H9 37°C temperatūrā. Pēc 4 nedēļu augšanas barotne tika atjaunota, un kultūra tika regulāri uzraudzīta, līdz tika novērota augšana. Šūnas tika savāktas ar centrifugēšanu, nogulsnes tika atkārtoti suspendētas 500 µl fosfātu buferētā fizioloģiskā šķīdumā (PBS), karsētas 99°C temperatūrā 30 minūtes, centrifugētas un supernatants tika uzglabāts -20°C temperatūrā līdz WGS. Visas procedūras tiek veiktas 3. līmeņa biodrošības telpās.
WGS pāroto galu genoma bibliotēka tiek sagatavota, izmantojot katra DNS parauga unikālo indeksu, un sekvencēšanai tiek izmantota Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 paraugi) un HiSeq (2 × 150 pb) (divi izolāti) tehnoloģija (Eurofins Genomics, Vācija). Saskaņā ar ražotāja norādījumiem genoma DNS sekvencēšanai izmantojiet Illumina genoma analizatoru ar divpusēju moduļa stiprinājumu un bibliotēkas izveidei izmantojiet Illumina Nextera XT DNS bibliotēkas sagatavošanas komplektu.
Ņemot vērā no SRA atgūtos datus (n = 12), klona kompleksa identifikāciju var izmantot kā atbilstošās publikācijas 30, 41, 43 metadatus. Apsverot pilnu genomu, izņemot Mycobacterium bovis AF2122/97 un Mycobacterium bovis 3601, kas ir atpazīti Eu1 un Eu3 klona kompleksa 25, 29 locekļi, tas ir tāds pats kā Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI piekļuves numurs NC_000962.3) pilnais genoms. Genoma saskaņošana tiek veikta, izmantojot MAFFT (aminoskābju vai nukleotīdu secības vairāku saskaņošanas programma, 7.458. versija) un parametru -addfragments48. Pēc tam meklē dažādu klona kompleksu neesamību un/vai SNP pazīmju klātbūtni.
Jaunsekvencētais Mycobacterium bovis (n = 42) un saliktā genoma melnraksta oriģinālie lasījumi (n = 3) saskaņo kompleksu ar atsauces genomu Mycobacterium tuberculosis H37Rv, izmantojot vSNP cauruļvadu un dažādu klonu delēcijas un/vai SNP iezīmju klātbūtni. Tika veikta meklēšana.
Apkopot informāciju par pazīmju trūkumu un/vai SNP klātbūtni/neesamību, kā arī spoligotipa profiliem, lai piešķirtu genoma datus atbilstošajam klonālajam kompleksam. Četru melnraksta komplektu spoligotipa profilu nevar secināt, tāpēc tie ir iekļauti grupā "bez sarežģītības".
Šajā darbā ievērotā bioinformātikas darbplūsma sākas ar de novo montāžas un kartēšanas līdz atsauces stratēģijai, kuras mērķis ir izpētīt rekombinācijas notikumus un specifiskus genoma polimorfismus. 1. attēlā ir parādīta veikto darbību shēma. Rekombinācijas analīzē tiek izmantoti visi genomi, lai palielinātu secinājumu un saistīto indikatoru robustumu.
Lai samazinātu kļūdas genoma konsensa secību ģenerēšanā, mēs vispirms ieguvām de novo montāžu un pēc tam ieguvām kodola vairāku izlīdzināšanu. Unicycler cauruļvads pašlaik ir pieejams vietnē https://github.com/rrwick/Unicycler49 un tiek izmantots, lai veiktu 54 sekvencētu genomu de novo montāžu (42 jauni sekvencēti un 12 fastq faili, kas atgūti no SRA). Īsāk sakot, pirms montāžas no nulles, lasīšanas kvalitātes analīze tika veikta FastQC versijā 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) un Trimmomatic versijā 0.36 (tiek piemērota opcija "adapteru un citu apgaismojumam specifisku secību izgriešana no nolasījumiem" un "bāzu izgriešana no nolasījuma beigām, ja kvalitāte ir zemāka par sliekšņa kvalitāti 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Pēc tam genoma montāžai tika izmantots SPAdes optimizētājs49, bet pēcmontāžas optimizācijai - Pilon versija 1.1851. Lai izvairītos no nepareizas salikšanas, tika izvēlēts konservatīvs tiltošanas režīms, un k-mer lielums tika meklēts un izvēlēts starp 20% un 95% no nolasīšanas garuma. Ievērojiet SPAdes vadlīnijas un ņemiet vērā nolasīšanas lielumu, dzēsiet kontigus, kas ir mazāki par 300 bp, un nosakiet 20 nolasīšanas dziļuma pārklājuma robežu 52. De novo salikšanas stratēģijā netika noņemti tādi genoma reģioni kā ļoti atkārtotie prolīna-glutamāta (PE) un prolīna-prolīna glutamāta (PPE) paralogi.
De novo montāžas kvalitāte tiek novērtēta, izmantojot QUAST cauruļvadu (//quast.sourceforge.net/quast.html), kas atvieglo kontiga un M. bovis AF2122/97 atsauces genoma (NCBI pievienošanās numurs LT708304.1) kartēšanas atjaunošanu (kvalitātes parametrus skatīt 1. papildtabulā).
Ar vSNP cauruļvada (https://github.com/USDA-VS/vSNP) palīdzību jaunizveidotā M. bovis FASTQ fails no Illumina sekvencēšanas tiek salīdzināts ar M. bovis AF2122/97 atsauces genomu (LT708304.1). Saskaņā ar Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 labākās prakses ieteikumiem atkārtotai kalibrēšanai tiek izmantoti standarta filtra parametri vai variantu masas rādītāji. Rezultāti tiek filtrēti, izmantojot zemāko SAMtools masas rādītāju 150 un AC = 2. Izmantojiet arī Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/), lai pārbaudītu nolasījumus un izslēgtu piesārņojumu. Mūsu darbā izmantotais vSNP cauruļvads, kas tiek izmantots kartēšanai ar sekvencēšanas stratēģijām, pārbauda virkni definētu SNP un mērķu, kā arī izslēdz jauktas infekcijas scenārijus. Nolasītā genoma pārklājums ir labāks par 99% (1. papildtabula).
Lai izvairītos no kartēšanas kļūdām un nepareiziem SNP, variants ir jāizfiltrē šādos gadījumos: (1) to apstiprina mazāk nekā 20 lasījumi, (2) tas ir atrodams ar frekvenci, kas mazāka par 0,9, (3) tas ir vismaz vienā celmā, bet vismaz citā celmā ir nepilnības. Integrētā genomikas skatītāja (IGV) 2.4.19 versija (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 tika izmantota, lai vizuāli pārbaudītu SNP un pozīcijas ar kartēšanas vai izlīdzināšanas problēmām. Tā kā prolīna-glutamāta (PE) un prolīna-prolīna glutamāta (PPE) gēni ir ļoti dublēti un ir daļa no daudzgēnu saimes, Illumina sekvencēšana tos viegli pārprot un veic nepareizu kartēšanu, tāpēc tiem tiek dota priekšroka. Mikobaktēriju bioinformātikas darbplūsma, izmantojot kartēšanas stratēģiju ar sekvenci, lai apstiprinātu SNP, izņēma tuberkulozes kompleksa locekļus. Tāpēc no analīzes izfiltrējām PE/PPE gēnus un indeles.
Saskaņā ar Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), visi SNP ir iedalīti funkcionālās kategorijās. SnpEff cauruļvads (https://pcingola.github.io/SnpEff/) tiek izmantots, lai secinātu SNP sekas (sinonīmas vai nesinonīmas izmaiņas). Izveidota jauna Mycobacterium bovis AF2122/97 genoma datubāze (LT708304.1).
Kodola genoma daudzkārtējā izlīdzināšana tika veikta, izmantojot Parsnp v1.2, kas pašlaik ir pieejama vietnē https://github.com/marbl/parsnp57, izmantojot 69 pilnīgus genomu/melnrakstu komplektus (ar opciju -c), un kā atsauce tiek izmantots M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Tika veiktas četras kodola daudzkārtējās izlīdzināšanas: tikai Eu2 klonēšanas kompleksa locekļi (n = 37), ieskaitot visus Eiropas klonēšanas kompleksa locekļus (n = 44), ieskaitot Eiropas un Āfrikas klonēšanas kompleksa savienojuma punktu (n = 51), un šajā pētījumā iekļauti visi Mycobacterium bovis (n = 70).
Parsnp ģenerētais kodola izlīdzinājums tiek izmantots, lai, izmantojot CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 un RAxML, secinātu maksimālās ticamības (ML) filoģenētisko koku un veiktu 1000 vadītas replikācijas.
Lai paralēli pārbaudītu rekombinācijas notikumu klātbūtni, tiek izmantoti trīs dažādi algoritmi un bioinformātikas rīki: SplitsTree4 programmatūra, Gubbins (objektīva līnijas noteikšana, izmantojot rekombināciju nukleotīdu sekvencēs) cauruļvads un RDP4 (rekombinācijas noteikšanas programma, beta 4.101 versija) programmatūra.
Lai aprēķinātu bezsakņu filoģenētisko tīklu, tiek izmantota SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 ieviestā sadalīšanas dekompozīcijas metode, statistiskai pārbaudei izmantojot Phi testu, un nozīmīguma slieksnis ir p = 0,05. Kā ievades dati tiek izmantota Parsnp kodola daudzkārtējā izlīdzināšanas analīze, un kā tīkla standarts tiek realizēta sadalīšanas dekompozīcija.
Gubbins cauruļvads v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) darbojas ar noklusējuma parametriem kā vēl viens veids, kā novērtēt rekombinācijas ietekmi uz Mycobacterium bovis. Cauruļvadā ieviestais algoritms rekonstruē atbilstošo klona līniju. Mūsu datu kopas pilnīga genoma/melnraksta montāža un atsauces genoms (liellopu liellops AF2122/97, LT708304.1) ir savstarpēji saskaņoti un skenē SNP pozīciju katrā koka zarā, lai noteiktu SNP klasteru, kas attēlo rekombinācijas notikumu. Zara nulle Pieņemsim, ka rekombinācijas notikuma nav, kas nozīmē, ka SNP, kas rodas zarā, jābūt vienmērīgi sadalītiem. Kā ievades faili tiek izmantoti Parsnp kodola daudzkārtējie izlīdzinājumi un RAxML vislabāk novērtētais ML koks.
Visbeidzot, lai apstiprinātu Gubbins cauruļvada ierosināto reorganizācijas notikumu, seši RDP467 ieviestie algoritmi (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 un SiScan66) tiek piemēroti Parsnp kodola daudzkārtējai izlīdzināšanai ar noklusējuma iestatījumiem. Mēs noteicām, ka vismaz trim no RDP4 ieviestajiem algoritmiem ir konsekventi jāparāda svarīgs signāls, lai pārbaudītu katru rekombinācijas notikumu.
Ņemot vērā, ka gan Gubbins, gan RDP programmatūra meklē rekombinācijas signālus, pārbaudot kodola vairākkārtējo izlīdzināšanu logā līdz 500 bp, un apstiprinot, ka PE/PPE gēnu iekļaušana de novo montāžas laikā netraucēs atrastajiem rekombinācijas signāliem, turpmāka analīze tiek veikta, izmantojot homolinearitāti, pārbaudot rekombinācijas notikumu identificējošā gēna tuvumu. Sinlineārā karte, izmantojot pilnu genomu, tika konstruēta, izmantojot MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html), lai izslēgtu lokālas genoma translokācijas vai inversijas. Turklāt viss genoms tika izmantots, lai veiktu aminoskābju secības homolinearitātes analīzi, izmantojot SyntTax tīmekļa serveri (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Padziļinātāka no Portugāles daudzsaimnieku tuberkulozes sistēmas iegūtā genoma datu kopas analīze ir literatūrā minēto gēnu polimorfisma pārbaude. Šie gēni ir 37,38, un 3R kodējošais gēns, ko MTBC senči ieguvuši, izmantojot HGT (DNS labošanas, replikācijas un rekombinācijas) sistēmas komponentus 39. Izmantojiet ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) un DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/), lai aprēķinātu gēnu daudzveidību un nukleotīdu daudzveidību (π) un Tadžimas D neitrālā testa parametru ievadi.
Tika iegūts maksimālās ticamības (ML) filoģenētiskais koks, kas balstīts uz 69 Mycoplasma bovis izolātiem un atsauces genomiem (2.A attēls). Salīdzinot ar kokiem, kuru pamatā ir viens gēns, vai kokiem, kuru pamatā ir vairāki lokusi, šī stratēģija ļauj ģenerēt spēcīgākus kokus, kas neaptver visa genoma mainīgumu un tāpēc tiem ir zemāka spēja atšķirt sugas 68,69. ML koka topoloģiskā struktūra parasti atbilst klonu sarežģītajai klasifikācijai. Eu2 genoms ir sagrupēts vienā zarā, un arī Af1 genoms ir sagrupēts vienā zarā (2.A attēls). Rezultāts atbilst arī zināmajām Mycobacterium bovis evolūcijas attiecībām, tas ir, pastāv liela atšķirība starp Eu1 locekli un grupu, kas sastāv no visiem pārējiem klonālajiem kompleksiem un genomiem, bet klonālais komplekss 30 nav norādīts. Nelielo neatbilstību starp klonālo kompleksu un filoģenētiskajā kokā novēroto saistību var izskaidrot ar to, ka klonālais komplekss tiek aprakstīts, pamatojoties uz specifiskiem genoma reģioniem, savukārt filoģenētiskais koks ir balstīts uz vairākiem kodolu genomu izlīdzinājumiem, kas pārstāv visu genomu.
Maksimālās ticamības filoģenētiskais koks (GTR) tiek konstruēts, pamatojoties uz Mycobacterium bovis genoma kodola genoma izlīdzināšanu pirms (A) un pēc (B) rekombinācijas vietas noņemšanas. Zaro krāsas attēlo Mycobacterium bovis klona kompleksu: Eiropa 1 ir violeta, Eiropa 2 ir sarkana, Eiropa 3 ir zila, Āfrika 1 ir oranža un Āfrika 2 ir zaļa. Koks ir sakņots un zīmēts mērogā, un zara garums tiek mērīts kā katras vietas aizstāšana.
Mycobacterium tuberculosis komplekss tiek raksturots kā klonāli evolvēts, un lielākā daļa gadu gaitā uzkrāto pierādījumu apstiprina domu, ka notiekošie HGT un rekombinācijas notikumi nenotiks nosakāmā MTBC līmenī15,17,18.
Iepriekšējie darbi ir parādījuši, ka starp MTBC celmiem var būt ierobežota rekombinācija20,21, savukārt citos nav izdevies identificēt izmērāmus rekombinācijas notikumus70,71. Vēlreiz apspriest šo jautājumu, koncentrējoties uz Mycobacterium bovis, kas atšķiras no iepriekšējā darba, kurā tika ņemta vērā tikai Mycobacterium tuberculosis 70,71; vai apsvērt MTBC kopumā, gandrīz nepāstāvot M. bovis 20; vai apsvērt tikai ierobežojošas liellopu frakcijas. Šajā darbā esošajā mikobaktēriju datu kopā ir kopumā 70 celmi, kas pārstāv visus klonu kompleksus, kas izmantoti rekombinācijas skrīningam. Datu kopa ir mērogota atbilstoši četriem kumulatīviem līmeņiem: (1) Eu2 locekļi, (2) visi Eiropas klonu kompleksu locekļi (t.i., Eiropa), (3) Eiropas un Āfrikas klonu komplekss (Eu + Af) un (4) visas datu kolekcijas (ieskaitot genomus, kas nav iekļauti nevienā jau aprakstītajā klonēšanas kompleksā).
Lai sīkāk izpētītu šo hipotēzi, tika veikts sadalītās dekompozīcijas tīkls, lai novērtētu rekombinācijas notikumu neesamību starp genomiem, jo šī metode var vizualizēt senču attiecības starp indivīdiem un parādīt pretrunīgus filoģenētiskos signālus. Visas četras analīzes datu kopas apstiprināja cilpu esamību tīklā (tas ir, apgabalus, kas nesaplūst vienā kokā), taču Phi testam nav statistiska atbalsta (Eu2, p = 0,0956; Eiropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; visa datu kopa p = 0,2451), kas sniedz vājus pierādījumus reorganizācijas notikumu esamībai (3.A–D attēls).
Eiropā 2 genomi (n = 37) (A), Eiropas genomi (n = 44) (B), Eiropas un Āfrikas genomi (n = 51) (C) un viss datu kopums (n = 70) (D).
Pēc šīs analīzes un ņemot vērā cikliskos novērojumus visos tīklos, Gubbins cauruļvadā ieviestais rekonstrukcijas algoritms tika pielietots, lai rekonstruētu klonālo līniju un papildinātu rekombinācijas ietekmes uz M. bovis genomu novērtējumu. Secināt rekombinācijas notikumu kumulatīvo skaitu, no kuriem lielākā daļa notika terminālajos zaros (t. i., vienā genomā) (2. tabula). Šie rādītāji parāda visa datu kopas konsekvenci un norāda, ka rekombinācijas notikumu biežums ir 200 līdz 300 reizes lielāks nekā mutāciju biežums. Tiklīdz rho/theta parametrs, kas attēlo rekombinācijas un punktmutāciju relatīvos ātrumus zarā, šķiet, ir no 0,0037 līdz 0,0056 (3. tabula). Nesen publicētajā 38 M. bovis celma darbā tika konstatēta augstāka rho/theta vērtība (rho/theta = 0,1) nekā šajā datu kopā iegūtā, taču Patané un kolēģu darbā rekombinācijas parametru noteikšanai tika izmantota uz atsaucēm balstīta montāža. Procedurāla detaļa, kas saistīta ar montāžas procedūru, ir saistīta ar iespējamo rekombinācijas notikumu pārpilnību terminālajā atzarā.
Tālāk r/m parametrs atspoguļo rekombinācijas un mutāciju ieviešanas daudzveidības attiecību, un tā vidējā vērtība ir no 0,025 līdz 0,037, kas norāda, ka, salīdzinot ar mutācijām, rekombinācijai ir mazāka kopējā ietekme uz M. bovis ģenētisko daudzveidību (3. tabula). Plašākai salīdzināšanai līdzīga metode tika izmantota, lai novērtētu r/m parametru MTBC datu kopai, kas sastāv no 23 genomiem, uzrādot vidējo vērtību 0,48620, savukārt Patané un kolēģu 38 M. bovis datu kopai tā pierādīja, ka vidējā vērtība ir 0,98. Pirmajā pētījumā M. bovis darbā tika iekļauti tikai divi no 23 genomiem (M. bovis BCG un references celms), tāpēc iegūtā vērtība var būt neobjektīva M. tuberculosis genoma pārekspresijas dēļ. Otrajā ziņojumā analizētās Mycobacterium bovis populācijas galvenokārt tika iegūtas no Amerikas Savienotajām Valstīm un mājlopiem. Turpretī mūsu datu kopā ir pārstāvētas vairāk ģeogrāfisko atrašanās vietu un saimnieku sugu, un tiek izmantoti arī genomi, kas sagrupēti dažādos klonu kompleksos ar atšķirīgām populācijas ģenētiskajām īpašībām, tādējādi panākot dziļākas un plašākas zināšanas par populācijām. Ar mūsu datu kopu iegūtā r/m vidējās vērtības starpība atbilst koncepcijai, ka rekombinācijas pakāpe ievērojami atšķiras starp līnijām, kas piešķirtas vienai un tai pašai taksonomiskajai sugai, tāpēc šie rezultāti liecina, ka M. bovis klona kompleksam var būt rekombinācijas atšķirības. Šo ietekmi ierosina arī Didelot & Maiden72. Tomēr, ievērojami paplašinot šo datu kopu, iekļaujot lielāku M. bovis genomu skaitu, tiks vēl vairāk precizēts šis jautājums. Gan r/m, gan rho/theta parametri parāda mainīgumu starp zariem, un šis rezultāts atbilst ziņojumiem par citām baktēriju sugām72,73.
Visbeidzot, lai apstiprinātu Gubbins cauruļvada identificētos reorganizācijas notikumus, RDP4 programmatūrā tika izmantoti seši dažādi algoritmi, lai neatkarīgi pārbaudītu dažādus pamata vairāku salīdzinājumu rezultātus. Kopumā mazāk nekā puse no Gubbins identificētajiem notikumiem tika apstiprināti ar RDP4 (4. un 5. tabula). Ņemot vērā visu datu kopu, tika apstiprināti trīs rekombinācijas notikumi, divi no tiem ietvēra iekšējos mezglus, bet otrs - vienu genomu terminālajā zarā, kuram nevarēja piešķirt klonālos kompleksus (4. un 5. tabula). Notikumu identificēšana terminālajos zaros var norādīt, ka rekombinācija joprojām notiek mūsdienu M. bovis celmos vai rezultāts ir nepareizs70. Šajā hipotētiskajā rekombinācijas reģionā aptuveni 20% pozīciju ir nedefinēti nukleotīdi (N), tādējādi ietekmējot rekombinācijas signālu (2. papildattēls). Turklāt šis reģions ietekmē rrs gēnu, kas kodē 16S ribosomu RNS, kurai, domājams, ir ļoti konservatīva, tāpēc šis iespējamais rekombinācijas signāls var būt sekvencēšanas kļūdu vai nepareizas izlīdzināšanas rezultāts. Pēc tam tika veikta pilnīga genoma izlīdzināšana starp Mb0003 un Mycobacterium bovis AF2122/97, un tika apstiprināta nedefinētu nukleotīdu un SNP esamība, tāpēc iespējamās problēmas, kas saistītas ar nepareizu izlīdzināšanu, nebija saistītas ar šajā darbā ieviesto bioloģisko informāciju, kas parādījās pēc programmas apgūšanas.
Iekšējo mezglu rekombinācijas reģionos netika atrastas nepilnības vai nedefinēti nukleotīdi (4. un 5. attēls). Attiecībā uz šiem notikumiem viens satur tikai Eu2 genomu un ietekmē pks12 gēnu, kas kodē iespējamu poliketīda sintāzi; savukārt otrs ir reģistrēts Eu1 genomā un ietekmē narX gēnu, kas kodē iespējamu nitrāta reduktāzi (4. tabula). Kopumā rekombinācijas analīze liecina, ka ir ierobežots skaits rekombinācijas fragmentu ar statistisku atbalstu, un secinātie indikatori norāda, ka rekombinācijai ir maza ietekme uz M. bovis līniju. Paredzams, ka rekombinācijas signāls būs zems, taču ir svarīgi atšķirt patieso evolūcijas signālu no fona trokšņa, kas ir sarežģīts uzdevums. Lai samazinātu trokšņa signālu, ko rada uz atsaucēm balstīta montāža un neatbilstības problēmas 70, 71, visi pārējie, izņemot pilno genomu, tika salikti no nulles, un montāžas kvalitāte tika pārbaudīta un nodrošināta ar QUAST cauruļvada analīzi (1. papildtabula). Turklāt tika veikta virkne papildu analīžu, lai nodrošinātu kopējās apsekojuma robustumu un precizitāti. Tāpēc narX un pks12 gēnu sekvencēšanas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot nolasīšanas kartēšanu pret Mycobacterium bovis AF2122/97. Ieteicamā SNP pozīcija rekombinācijas reģionā tika apstiprināta, piemērojot metodes sadaļā minētos kritērijus (vismaz 20 nolasījumi un 0,9 izmaiņu frekvence). narX gēna polimorfisms tika pilnībā apstiprināts divos genomos (Mb1792361 un Mb7240415; 2,3%) un pks12 genoma genomos: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 un Mb12 gēnos. Tomēr genomam Mb2043 sešas no astoņām pozīcijām neatbilst nolasīšanas dziļuma kritērijam, jo SNP atbalsta maksimāli 17 nolasījumi, kas ir zem noteiktās robežvērtības 20. Tādēļ šajā genoma vietā var apstiprināt sešu genomu (8,6%) rekombināciju (4. un 5. attēls).
Detalizēta Mycobacterium bovis datu kopas rekombinācijas reģiona izlīdzināšanas vizualizācija ietekmē narX gēnu, kas kodē iespējamu nitrātu reduktāzi. Iekšējo mezglu rekombinācijas reģionā netika atrasti tukšumi vai nedefinēti nukleotīdi. Šis konkrētais notikums ir reģistrēts Eu1 genomā. NarX gēna sekvencēšanas kvalitāte tika novērtēta, uzzīmējot Mycobacterium bovis AF2122/97 nolasījumus. Apstipriniet ieteicamo SNP atrašanās vietu rekombinācijas apgabalā, piemērojot metodes sadaļā minētos kritērijus (vismaz 20 nolasījumi un 0,9 izmaiņu frekvence). NarX gēna polimorfisms tika pilnībā apstiprināts Mb1792361 un Mb7240415 genomos (2,3%).
Detalizēta Mycoplasma bovis datu kopas rekombinācijas reģiona izlīdzināšanas vizualizācija, kas ietekmē pks12 gēnu. Iekšējo mezglu rekombinācijas reģionā netika atrasti tukšumi vai nedefinēti nukleotīdi. Attiecībā uz notikumu, kas ietekmē pks12 gēnu, kas kodē iespējamo poliketīda sintāzi, tas satur tikai Eu2 genomu. pks12 sekvencēšanas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot Mycobacterium bovis AF2122/97 nolasīšanas kartēšanu. Apstipriniet ieteicamo SNP atrašanās vietu rekombinācijas apgabalā, piemērojot metodes sadaļā minētos kritērijus (vismaz 20 nolasījumi un 0,9 izmaiņu frekvence). Genomu Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 un Mb1960 polimorfismi ir pilnībā apstiprināti.
PE un PPE gēniem ir atkārtoti reģioni, kurus Illumina sekvencēšana un nepareiza kartēšana var viegli nolasīt nepareizi, tāpēc tie parasti tiek dzēsti no M. tuberculosis locekļu bioinformātikas darbplūsmas tikai tad, ja tiek izmantota kartēšanas uz secību stratēģija. Šajā darbā pielietotā rekombinācijas notikumu secinājums ir balstīts uz de novo montāžu, neizfiltrējot PE/PPE. Mēs uzskatām, ka, ieviešot trīs dažādas savstarpēji papildinošas metodes un algoritmus, izmantojot SplitsTree, Gubbins cauruļvadu un RDP4 programmatūru, pielietotās stratēģijas ir izturīgas pret reorganizēto reģionu apstrādi un filtrēšanu, ko izraisa kļūdu signāli. Tomēr, lai izslēgtu PE/PPE gēna ietekmi uz Gubbins un RDP4 programmatūru SNP klasteru identificēšanā un līdz ar to rekombinācijas reģionu identificēšanu, kuriem, domājams, ir ietekme uz narX un pks12 gēniem, tika pārbaudīta šo gēnu apkārtne (3.–5. papildattēls). M. bovis AF2122/97 gadījumā narX gēnu atdala narK2 un Mb1764c, savukārt pks12 ieskauj Mb2075c un Mb2073c (3.-5. papildattēls). Karte, kas ģenerēta, izmantojot pilna genoma MAUVE sinlīnijas karti, sniedz informāciju par gēnu secības saglabāšanos un pārkārtošanos, parādot četrus kolineārus blokus un nekādas genoma translokācijas vai inversijas pazīmes. Turklāt komplementācijas analīze ar aminoskābju secību pierādīja homoloģiju visos pilnajos genomos, un blakus esošajos narX vai pks12 reģionos netika atrasts PE/PPE. NarX gadījumā vienam genomam (Mb0030) ir zemāks sinonīmijas rādītājs, jo narX gēns tika identificēts kā divi fragmenti (fragmenti 1891 un 1890). pks12 gadījumā, līdzību dēļ, Mb0030 un Mb003 uzrādīja zemākus sinlinearitātes rādītājus, savukārt pks12 tika identificēts attiecīgi divos un trīs fragmentos, kas pārstāv dažādus proteīna domēnus (3.-5. papildattēls). Ņemot vērā šo informāciju un to, ka gan Gubbins, gan RDP4 programmatūra veic analīzi, pārbaudot maksimāli 500 bp garo kodolu vairāku fragmentu izlīdzināšanu logā, mēs apstiprinājām, ka PE/PPE gēns netraucēs rekombinācijas signālam, kas ietekmē narX un pks12.
Lai gan šajā datu kopā konstatētie rekombinācijas signāli var tikt uzskatīti par atlikušiem, ir taisnība, ka rekombināciju M. bovis nevar izslēgt, tāpēc tā jāturpina analizēt, kurā veseli genomi no dažādiem epidemioloģiskiem scenārijiem tiek sekvencēti līdz svarīgiem.
Salīdzinot pirms un pēc rekombinācijas korekcijas iegūtos ML filoģenētiskos kokus (2.A, B attēls), netika konstatētas būtiskas izmaiņas secinātajā filoģenētiskajā attiecībā, un M. bovis celmi tika grupēti vienā grupā.
Pēc 42 jaun sekvencētu M. bovis lasījumu kartēšanas ar M. bovis AF2122/97 atsauces genomu tika iegūta SNP izlīdzināšana, kas satur 1816 polimorfas pozīcijas. Lielākā daļa SNP (87,1%) atrodas kodējošajā reģionā, un skartie gēni ir raksturoti atbilstoši Bovilist attēlotajām funkcionālajām kategorijām (6A., B. attēls). Ņemot vērā kopējo gēnu skaitu katrā funkcionālajā kategorijā, gēniem "lipīdu metabolisms" kategorijā bija vairāk SNP, kam sekoja "šūnas sieniņa un šūnas procesi" un "starpposma metabolisms un elpošana", atklājot, ka tie atrodas M. bovis evolūcijā.
Portugāles M. bovis datu kopas hierarhiskā analīze (n = 42). Reģistrēto SNP un skarto gēnu kopējais skaits katrā funkcionālajā kategorijā (A). Reģistrēto sinonīmo un nesinonīmo izmaiņu kopējais skaits pa funkcionālajām kategorijām (B).
Globālā mērogā vidējā dN/dS attiecība ir labāka par 1,5, kas norāda, ka globālais evolūcijas spiediens ir atbrīvoties no senču stāvokļa un atspoguļo pozitīvu (dažādu vai virzītu) un/vai atvieglotu attīrīšanas izvēles scenāriju. Kategorijās "virulence, detoksikācija, adaptācija", "ievietošanas sekvences un fāgi" un "regulējošie proteīni" vairāk nekā divas trešdaļas SNP nav sinonīmi (6.B attēls).
Visās kategorijās ir gēni ar vairākiem SNP, kā rezultātā vidējais mutāciju līmenis (tas ir, vidējais SNP uz gēnu) ir lielāks par 1 (6.A attēls). Pks12 (Mb2074c) ar 15 SNP un fas (Mb2553c) ar 8 SNP ir augstākas mutāciju vērtības. Abi šie gēni ir iesaistīti taukskābju metabolismā. pks gēns kodē poliketīdu sintāzi (PKS), kas ir daudzfunkcionāls enzīms, kas iesaistīts mikobaktēriju šūnu sieniņu lipīdu biosintēzē74,75. Šis gēns kodē daudzfunkcionālu polipeptīdu, kas ir iesaistīts mikoketīdu sintēzē74,76. Fas gēns ir iesaistīts mikolskābes sintēzē. Abiem šiem gēniem ir svarīga loma šūnu sieniņu biosintēzē, saskaroties ar saimnieku.
Lai turpinātu pētīt Mycobacterium bovis evolūciju, tika analizēti divi specifisku gēnu komplekti. Iepriekš publicētos darbos, izmantojot secības sastāva un filoģenētiskās metodes, tika identificēti gēni, ko MTBC senči ieguva, izmantojot HGT, pirms diversifikācijas37,38. Šie gēni ir uzskaitīti 2. papildtabulā. Tika analizēts kopumā 77 gēnu, kas varētu būt saistīti ar HGT, SNP sadalījums, un tika identificētas 26 polimorfas vietas, kas vairumā gadījumu (78%) izraisīja nesinonīmiskas (NS) izmaiņas (2. papildtabula). Iepriekšējais darbs ar MTBC genomu parādīja, ka iespējamajam HGT reģionam ir augstāka NS SNP attiecība salīdzinājumā ar pārējo genomu. Ja tiek uzskatīts, ka šos rekombinācijas reģionus ieguva MTBC senči, un tāpēc tie pārreprezentē senos polimorfismus, tad paredzams, ka sinonīmo izmaiņu īpatsvars būs lielāks, jo paredzams, ka NS aizvietojumi tiks eliminēti ar negatīvu atlasi aminoskābju izmaiņu dēļ, kas var mainīt proteīna funkciju. Tāpēc mūsu rezultāti liecina, ka funkcionālās sekas var rasties HGT līdzīgu gēnu aizstāšanas rezultātā, kas atspoguļo to nozīmi vērtīgā adaptīvajā ģenētiskajā daudzveidībā.
Paralēli šai analīzei tika rūpīgi pārbaudīti gēni, kas kodē 3R (DNS atjaunošanas, replikācijas un rekombinācijas) sistēmas komponentus saskaņā ar sarakstu, ko iepriekš publicēja dos Vultos un līdzstrādnieki (2008)39. Identisku DNS fragmentu apmaiņu nevar tieši novērot, lai gan tas var būt biežs process, ja ir iesaistītas cieši radniecīgas baktērijas, piemēram, šī datu kopuma gadījumā; turklāt šis process var būt atslēga DNS atjaunošanas metodēm72, tāpēc tam ir nozīme homologā rekombinācijā. Kopumā tika identificētas 26 polimorfas pozīcijas, kas sadalītas pa 54 gēniem (3. papildtabula). Šajā gēnu kopā NS izmaiņas veidoja aptuveni 65% no sekām, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem par Mycobacterium tuberculosis celmiem.
Publicēšanas laiks: 2021. gada 21. oktobris