Hvala, ker ste obiskali Nature. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite novejšo različico brskalnika (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Hkrati bomo za zagotovitev nadaljnje podpore prikazali spletna mesta brez slogov in JavaScripta.
Sekvenciranje genoma je oživilo področje raziskav nalezljivih bolezni in razkrilo epidemiologijo bolezni, patogenezo, interakcije med gostiteljem in patogenom ter evolucijski proces, ki ga povzročajo patogeni. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) obravnava Mycobacterium bovis kot enega od svojih živalskih adaptivnih članov, ki povzročajo tuberkulozo (TB) pri kopenskih sesalcih, in je tipičen model bakterijske evolucije. Tako kot drugi člani MTBC se tudi Mycobacterium bovis domneva, da je strogo kloniran, počasi razvijajoč se patogen in očitno ni znakov rekombinacije ali horizontalnega prenosa genov. V tem delu uporabljamo primerjalno genomiko na naboru podatkov celotnega genomskega zaporedja (WGS), sestavljenem iz 70 vrst goveda M. iz različnih rodovnikov (Evropa in Afrika), da bi dobili vpogled v genetsko raznolikost vrste M. Evolucijska moč. Za oceno znakov reorganizacije se uporabljajo tri različne metode. Globalno je bilo z dvema neodvisnima metodama s trdno podporo identificiranih in potrjenih majhnih rekombinacijskih dogodkov. Kljub temu ima rekombinacija v primerjavi z mutacijami šibkejši učinek na raznolikost vrste M. bovis (skupni r/m = 0,037). Razlika v povprečju r/m, dobljena v klonskem kompleksu Mycobacterium bovis v našem naboru podatkov, je skladna s splošnim konceptom, da se stopnja rekombinacije lahko zelo razlikuje med linijami, dodeljenimi isti taksonomski vrsti. Na podlagi tega dela rekombinacije pri Mycobacterium bovis ni mogoče izključiti, zato bi morala biti predmet nadaljnjih prizadevanj v prihodnjih primerjalnih genomskih raziskavah, pri katerih je ključnega pomena WGS velikih naborov podatkov iz različnih epidemioloških scenarijev po vsem svetu. Nato je bila izvedena dodatna analiza manjšega nabora podatkov Mycobacterium bovis (n = 42) iz prevalence tuberkuloze pri več gostiteljih in identificiranih je bilo več kot 1800 lokusov, od katerih je vsaj en sev pokazal polimorfizem enega nukleotida (SNP). Večina (87,1 %) se nahaja v kodirajoči regiji, globalno razmerje nesinonimnih sprememb (dN/dS) sinonimnih sprememb pa presega 1,5, kar kaže, da je pozitivna selekcija pomembna evolucijska sila, ki deluje na M. bovis. Večji delež SNP-jev je bil odkrit v genih, bogatih s funkcionalnimi kategorijami "presnova lipidov", "celična stena in celični procesi" ter "vmesni metabolizem in dihanje", kar razkriva njihov potencial v biologiji in evoluciji pomena Mycobacterium bovis. Podrobnejši pogled na gene v prednikih MTBC, ki so nagnjeni k horizontalnemu prenosu genov in so vključeni v sistem 3R (popravilo, replikacija in rekombinacija DNK), razkriva globalno povprečno negativno vrednost Taijiminega D nevtralnega testa, kar kaže na preteklo selektivno skeniranje. Nedavno ozko grlo po širitvi populacije je še vedno glavni evolucijski dejavnik, ki ovira obvezni patogen Mycobacterium bovis v boju proti gostitelju.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) je eden najuspešnejših taksonov bakterijskih patogenov in tipičen primer bakterijske evolucije. Njegovi člani kažejo presenetljivo visoko nukleotidno identiteto na genomski ravni (> 99 %)1,2. Različni ekotipi MTBC lahko povzročijo tuberkulozo (TB), ki je infekcijska granulomatozna bolezen, pri širokem spektru gostiteljskih vrst, od mikrosesalcev do ljudi3,4,5. Trenutno kompleks vključuje ljudi [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] in patogene, prilagojene živalim (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" in "dassie")5,6. M. canettii (znan tudi kot "Nodobacter glabrata") Povprečna nukleotidna identiteta z zgoraj omenjenimi mikobakterijami je 98 %, primerjalne genomske raziskave pa so pokazale, da sta se M. canettii in preostali del MTBC pred kratkim oddaljila od skupnega prednika.7 Glede na ta koncept nekateri avtorji imenujejo M. canettii član MTBC 8.
MTBC je sistematično opisan kot strogi klonski kompleks, njegovo populacijsko strukturo pa jasno določajo zmanjšana raznolikost, ozka grla, selektivno skeniranje in genetski drift9,10. Ob predpostavki, da kompleksne stroge klonske evolucije, kot so manjkajoči polimorfizmi, ni mogoče obnoviti z rekombinacijo. Na podlagi te predpostavke so bili zaporedni dogodki genomske delecije diferencialne regije (RD) in TbD1 (regija specifične delecije 1 za Mtb) predlagani kot molekularni označevalci evolucije MTBC2,5,11. Delo na področju primerjalne genomike in sekvenciranja celotnega genoma (WGS) podpira delitev članov, prilagojenih človeku, v devet linij (Mycobacterium tuberculosis L1 do L4, L7 in L8; ter Mycobacterium africanum L5, L6 in L9), linije L2 do L4 pa si delijo delecijsko regijo TbD12,11,12,13. Poleg tega se predlaga, da imajo člani, prilagojeni živalim, skupnega prednika, ki je opredeljen s kladno specifičnimi delecijami v RD7, RD8, RD9 in RD102, 5 in 14.
Horizontalni prenos genov (HGT) in rekombinacijski dogodki veljajo za redke in se pojavljajo pri prednikih MTBC, ne pa za različno zgodovino celotnega člana MTBC15,16,17. Dve zgodnji poročili Hughesa in sodelavcev (2002) ter Gutackerja in sodelavcev (2006) sta nakazovali, da lahko rekombinacijski dogodki pomagajo oblikovati polimorfizme, ki označujejo specifične lokuse v sevih M. tuberculosis18,19. Razlogi za očitno pomanjkanje rekombinacije pri MTBC so: (1) mehanski proces in izguba sposobnosti HGT; (2) redkost dogodkov HGT; (3) ni možnosti za rekombinacijske dogodke v niši MTBC14,17. Nedavno so nekatere študije sekvenciranja celotnega genoma (WGS), uporabljene za sev MTBC 20 in Mycobacterium bovis 21, zagotovile dokaze o rekombinaciji, prve, ki so pokazale, da sevi MTBC pogosto izmenjujejo majhne fragmente DNK, vendar zaradi omejene variacije nukleotidnega zaporedja ti dogodki še vedno niso opaženi.
Mycobacterium bovis je najpogosteje odkrit član MTBC iz živine (predvsem goveda), čeprav ga je mogoče izolirati tudi iz divjih živali proste reje in ograjenih divjih živali4,22,23,24. M. bovis se je razvil v pet glavnih klonskih kompleksov [evropski 1 (Eu1), evropski 2 (Eu2), evropski 3 (Eu3), afriški 1 (Af1) in afriški 2 (Af2)], v skladu s profilom spolignotipizacije, specifičnimi delecijami in polimorfizmi enega nukleotida (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 v specifičnih genih. Ti klonski kompleksi kažejo na raznoliko strukturo populacije Mycobacterium bovis in njeno povezanost z geografskimi regijami. Poleg tega je nedavno delo WGS, ki so ga izvedli Zimpel in sodelavci (2020), zasnovalo filogenijo, ki temelji na SNP Mycobacterium bovis, z več kot 1900 genomi, kar kaže na obstoj vsaj štirih različnih linij (imenovanih Lb1 do Lb1 do Lb4), ki pa niso popolnoma skladne s prej opredeljenim klonskim kompleksom, čeprav je mogoče potrditi tudi geografsko specifičnost30. Ti avtorji so izvedli diferencialno analizo filogenije in molekularnega datiranja, vendar niso preučevali rekombinacije30.
Prejšnje delo z različnimi molekularnimi tehnikami, kot so spoligotipiranje, MIRU-VNTR (mikobakterijsko vmesno ponavljajoče se enote - spremenljivo tandemsko število ponovitev) in nedavno SNP tipiziranje, je razkrilo določeno stopnjo genetske raznolikosti med sevi M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Diferenciacija genetskih variacij je postala pomembno orodje pri preučevanju epidemiologije bolezni, kar je koristno za poglobljeno razumevanje patogeneze, virulence in prenosa bolezni. Pojav metode WGS omogoča razkritje evolucijskih gonilnih dejavnikov, ki jih nalaga genom Mycobacterium bovis v procesu prilagajanja in vztrajnosti na različne gostitelje in epidemiološke scenarije.
V tem delu uporabljamo primerjalno genomsko analizo različnih naborov podatkov o Mycoplasma bovis (n = 70), vključno z izolati iz različnih klonskih kompleksov, da bi dobili vpogled v evolucijski proces Mycoplasma bovis, zlasti za razrešitev filogenetskih odnosov in rekombinacijskih dogodkov. Kot dopolnilo tej analizi je bil nadalje raziskan podnabor izolatov M. bovis (n = 42), pridobljenih z dobro označenega območja tuberkuloze z več gostitelji na Portugalskem 31,36, da bi sklepali na neidentičnost. Ravnovesje med relativnim razmerjem med smiselnimi (dN) in sinonimnimi (dS) nukleotidnimi substitucijami ter evolucijski prispevek specifičnih genomov, omenjenih v literaturi, so 37,38 pridobljeni od prednikov MTBC s pomočjo HGT in kodirajo genske komponente sistema 3R (popravljanje, replikacija in rekombinacija DNA) 39. Izberemo gene, pridobljene s HGT, ker lahko predstavljajo starodavne polimorfizme, zato se pričakuje, da lahko vsebujejo večji delež sinonimnih sprememb. Geni, vključeni v sistem 3R, so bili izbrani, ker je prejšnje delo na sevih M. tuberculosis pokazalo splošne negativne/čistilne selekcije, ki delujejo na te gene, in ti geni lahko igrajo pomembno vlogo v evoluciji 39. Drug cilj tega dela je sklepati na obstoj reorganizacijskih dogodkov. Zaradi tega, glede na to, da naš nabor podatkov iz Portugalske vsebuje le genome evropskega klonskega kompleksa 2 in seve, ki jim klonski kompleks ni bil dodeljen, smo se odločili vključiti javno dostopne podatke o genomu, da bi končno dobili reprezentativen prikaz vseh klonskih kompleksov ter izboljšali robustnost in širino rezultatov.
V središču tega dela je 42 na novo sekvenciranih genomov Mycoplasma bovis s portugalske endemične večgostiteljske scene tuberkuloze (podrobnosti spodaj), ki so bili predhodno okarakterizirani z epidemiološkega vidika36. Glede na to, da nabor podatkov iz Portugalske vsebuje le predstavnike evropskih klonskih kompleksov 2 in seve brez določenih kompleksov, so bili dodani javno dostopni podatki o sekvenciranju celotnega genoma, da bi razširili nabor podatkov, ki vključuje vse predstavnike klonskih kompleksov M. bovis. Zato so bili v tem delu uporabljeni trije viri podatkov o sekvenciranju celotnega genoma: celotna/osnutek sestave genoma, do 10 ogrodij, shranjenih v NCBI (Nacionalni center za biotehnološke informacije) (n = 15 izolatov); shranjena v SRA (datoteka Illumina fastq arhiva prebranih zaporedij), ki predstavlja kompleksno raznolikost klonov M. bovis (n = 12 izolatov)30; in 42 na novo sekvenciranih genomov iz Portugalske. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) je bil izključen iz iskanja NCBI. M. bovis AF2122/97 se običajno uporablja kot referenčni genom, ki se vključi v nabor podatkov. Ker celotno zaporedje genoma, ki ga predstavlja klonirni kompleks African 1, ni javno dostopno, in ker ni veliko genomov iz reprezentativnih sevov Af2 in Eu1, so bili v teh primerih uporabljeni originalni podatki sekvenciranja, ki jih je zagotovila SRA. Delo Zimpela in njegovih sodelavcev (2020) je pomagalo identificirati genom iz prej omenjenega klonirnega kompleksa in izbrati Mycobacterium bovis za vključitev v nabor podatkov. Za Eu3 je opisan le en tip genoma (Branger et al., 2020), zato je genom, ki ga vključujemo, ločen predstavnik kompleksa Eu3.
Ta nabor podatkov globalno vključuje 70 vrst goveda M. bovis, izoliranih iz 8 gostiteljskih vrst, razširjenih v 12 državah od leta 1985 do 2016. 36 vrst je označenih kot Eu2, 7 vrst kot Eu1, 1 vrsta kot Eu3, 3 vrste kot Af1, 4 vrste kot Af2 in 19 jih ni mogoče pripisati nobenemu klonskemu kompleksu (podrobnosti spodaj). Podrobne informacije (vključno s pristopno številko) o Mycobacterium bovis, uporabljenih v tej študiji, so prikazane v tabeli 1 in dodatni tabeli 1.
V središču te študije je 42 na novo sekvenciranih celih genomov Mycobacterium bovis z žarišč živalske tuberkuloze na Portugalskem, ki so bili razširjeni več kot 12 let, saj so bili potencialni sistemi bolezni divjih živali in živine redno spremljani 31,36 (dodatna slika 1). V skladu z nadaljnjimi postopki so bili ti sevi izolirani iz goveda (n = 14), jelenjadi (n = 16) in divjega prašiča (n = 12) od leta 2003 do 2015: živali je treba zbrati in z njimi ravnati v skladu s priporočenimi protokolarnimi smernicami. Vzorci tkiva so v Priročniku za kopenske živali OIE in so inokulirani na trdnem in tekočem gojišču s piruvatom Stonebrink in Löwenstein-Jensen. Kulture se inkubirajo pri 37 °C, rast pa se preverja enkrat na teden vsaj 12 tednov. Kolonije se shranjujejo neposredno v raztopini glicerola pri -80 °C. V selektivnem gojišču Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) so bili originalni arhivirani vzorci enkratno preneseni skozi in vitro pasažo, da bi dobili DNK programa WGS. Za to je bila zamrznjena osnovna raztopina kulture obogatena s 5 % natrijevega piruvata in 10 % ADS (50 g albumina, 20 g glukoze, 8,5 g natrijevega klorida v 1 l vode) na gojišču Middlebrook 7H9 pri 37 °C Retrain. Po 4 tednih rasti je bil medij obnovljen in kultura je bila redno spremljana, dokler ni bila opažena rast. Celice so bile pobrane s centrifugiranjem, pelet je bil resuspendiran v 500 µL fosfatno puferirane fiziološke raztopine (PBS), segrevan pri 99 °C 30 minut, centrifugiran in supernatant shranjen pri -20 °C do WGS. Vsi postopki se izvajajo v objektih biološke varnosti stopnje 3.
Knjižnica genoma WGS s parnimi konci je pripravljena z uporabo edinstvenega indeksa vsakega vzorca DNK in za sekvenciranje uporablja tehnologijo Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 vzorcev) in HiSeq (2 × 150 pb) (dva izolata) (Eurofins Genomics, Nemčija). V skladu z navodili proizvajalca za sekvenciranje genomske DNK uporabite analizator genoma Illumina z dvostranskim priključkom za modul, za izdelavo knjižnice pa komplet Nextera XT DNA Library Prep Kit podjetja Illumina.
Ob upoštevanju podatkov, pridobljenih iz SRA (n = 12), se lahko identifikacija klonskega kompleksa uporabi kot metapodatki ustrezne publikacije 30, 41, 43. Pri obravnavi celotnega genoma, razen za Mycobacterium bovis AF2122/97 in Mycobacterium bovis 3601, ki sta prepoznana člana klonskega kompleksa Eu1 in Eu3 25, 29, je enak celotnemu genomu Mycobacterium tuberculosis H37Rv (pristopna številka NCBI NC_000962.3). Poravnava genoma se izvede z uporabo MAFFT (program za večkratno poravnavo aminokislinskega ali nukleotidnega zaporedja, različica 7.458) in parametra -addfragments48. Nato se poišče odsotnost različnih klonskih kompleksov in/ali prisotnost značilnosti SNP.
Novo sekvencirani Mycobacterium bovis (n = 42) in originalni odčitki sestavljenega osnutka genoma (n = 3) poravnajo kompleks z referenčnim genomom Mycobacterium tuberculosis H37Rv prek cevovoda vSNP in prisotnosti delecijskih in/ali SNP značilnosti različnih klonov. Izvedeno je bilo iskanje.
Zberite informacije iz pomanjkanja značilnosti in/ali prisotnosti/odsotnosti SNP in profilov spoligotipizacije, da dodelite genomske podatke ustreznemu klonskemu kompleksu. Za štiri osnutke sestavov profila spoligotipizacije ni mogoče sklepati, zato so vključeni v skupino »brez kompleksnosti«.
Bioinformatični potek dela, ki mu sledi to delo, se začne z de novo sestavljanjem in preslikavo v referenčno strategijo, s ciljem raziskovanja rekombinacijskih dogodkov in specifičnih polimorfizmov genoma. Slika 1 prikazuje diagram poteka naslednjih korakov. Za analizo rekombinacije se uporabljajo vsi genomi za povečanje robustnosti sklepov in sorodnih kazalnikov.
Da bi zmanjšali napake pri generiranju konsenznih zaporedij genoma, smo najprej pridobili de novo sestavljanje, nato pa še večkratne poravnave jeder. Cevovod Unicycler je trenutno na voljo na https://github.com/rrwick/Unicycler49 in se uporablja za izvedbo de novo sestavljanja 54 sekvenciranih genomov (42 na novo sekvenciranih in 12 datotek fastq, pridobljenih iz SRA). Skratka, pred sestavljanjem iz nič je bila izvedena analiza kakovosti branja v programih FastQC različice 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) in Trimmomatic različice 0.36 (uporabi se možnost "izrezovanje adapterjev in drugih zaporedij, specifičnih za osvetlitev, iz odčitkov" in "Izrezovanje baz s konca branja, če je kakovost nižja od praga 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic)50. Nato smo za sestavljanje genoma uporabili SPAdes optimiser49, za optimizacijo po sestavljanju pa Pilon različice 1.1851. Izbran je bil konzervativen način premostitve, da bi se izognili napačnemu sestavljanju, velikost k-mer pa je bila poiskana in izbrana med 20 % in 95 % dolžine branja. Sledite smernicam SPAdes in upoštevajte velikost branja, izbrišite kontige, manjše od 300 bp, in določite mejo pokritosti globine 20 branja na 52. Pri strategiji sestavljanja de novo genomske regije, kot so visoko ponavljajoči se paralogi prolin-glutamata (PE) in prolin-prolin glutamata (PPE), niso bile odstranjene.
Kakovost de novo sestave se ocenjuje s pomočjo cevovoda QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), ki omogoča obnovo kontiga in kartiranja referenčnega genoma M. bovis AF2122/97 (pristopna številka NCBI LT708304.1) (za parametre kakovosti glejte dodatno tabelo 1).
S pomočjo cevovoda vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP) se datoteka FASTQ na novo sekvenciranega M. bovis iz sekvenciranja Illumina primerja z referenčnim genomom M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). V skladu s priporočili za najboljšo prakso kompleta orodij za analizo genoma (GATK) 53, 54, 55 se za ponovno kalibracijo uporabijo standardni parametri filtra ali variantne masne ocene. Rezultati se filtrirajo z uporabo najnižje masne ocene SAMtools 150 in AC = 2. Za preverjanje odčitkov in izključitev kontaminacije uporabite tudi Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/). Cevovod vSNP, ki se v našem delu uporablja za preslikavo v strategije zaporedja, preučuje vrsto definiranih SNP-jev in tarč ter izključuje tudi scenarije mešanih okužb. Pokritost odčitanega genoma je boljša od 99 % (dodatna tabela 1).
Da bi se izognili napakam pri preslikavi in napačnim SNP-jem, izločite varianto v naslednjih primerih: (1) podpira jo manj kot 20 odčitkov, (2) najdena je s frekvenco manjšo od 0,9, (3) prisotna je v vsaj enem sevu, vendar so vrzeli vsaj v drugem sevu. Za vizualno preverjanje SNP-jev in položajev s težavami pri preslikavi ali poravnavi je bil uporabljen integrirani pregledovalnik genomike (IGV) različice 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56. Ker so geni prolin-glutamata (PE) in prolin-prolin glutamata (PPE) zelo podvojeni in so del večgenske družine, jih sekvenciranje in napačno preslikavanje z Illumino zlahka napačno razume, zato so prednostni. Potek dela mikobakterijske bioinformatike je pri uporabi strategije preslikave v zaporedje za potrditev SNP-jev odstranil člane tuberkuloznega kompleksa. Zato smo iz analize izločili gene PE/PPE in indele.
Po podatkih Bovilista (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) so vsi SNP-ji razdeljeni v funkcionalne kategorije. Za sklepanje o posledicah SNP-jev (sinonimne ali nesinonimne spremembe) se uporablja cevovod SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/). Ustvarjena je bila nova baza podatkov o genomu Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Večkratna poravnava jedrnega genoma je bila izvedena z uporabo programa Parsnp v1.2, ki je trenutno na voljo na https://github.com/marbl/parsnp57, z uporabo 69 popolnih genomov/osnutkov (z možnostjo -c), pri čemer je bil kot referenca uporabljen M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Izvedene so bile štiri večkratne poravnave jedrnega genoma: samo člani klonirnega kompleksa Eu2 (n = 37), vključno z vsemi člani evropskega klonirnega kompleksa (n = 44), vključno s stičiščem evropskega in afriškega klonirnega kompleksa (n = 51), in vključno z vsemi bakterijami Mycobacterium bovis v tej študiji (n = 70).
Poravnava jedra, ki jo generira Parsnp, se uporablja za sklepanje o filogenetskem drevesu največje verjetnosti (ML) z uporabo programa CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 z uporabo RAxML in izvedbe 1000 vodenih ponovitev.
Za vzporedno preverjanje prisotnosti rekombinacijskih dogodkov se uporabljajo trije različni algoritmi in bioinformatična orodja: programska oprema SplitsTree4, cevovod Gubbins (nepristransko določanje rodu skozi rekombinacijo v nukleotidnih zaporedjih) in programska oprema RDP4 (program za zaznavanje rekombinacije, različica beta 4.101).
Za izračun filogenetske mreže brez korenin se uporablja metoda dekompozicije z razdelitvijo, implementirana v SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59, pri čemer se za statistično preverjanje uporablja Phi test, prag pomembnosti pa je p = 0,05. Kot vhod se uporablja analiza več poravnav jedra Parsnp, dekompozicija z razdelitvijo pa se izvaja kot standard omrežja.
Gubbinsov cevovod v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) deluje s privzetimi parametri kot še en način za oceno vpliva rekombinacije na Mycobacterium bovis. Algoritem, implementiran v cevovodu, rekonstruira ustrezno klonsko linijo. Celoten genom/osnutek našega nabora podatkov in referenčni genom (goveji bovid AF2122/97, LT708304.1) sta medsebojno ujemajoča se; in skenira položaj SNP na vsaki veji drevesa, da zazna gručo SNP, ki predstavlja rekombinacijski dogodek. Ničla veje Predpostavimo, da ni rekombinacijskega dogodka, kar pomeni, da bi morali biti SNP-ji, ki se pojavijo na veji, enakomerno porazdeljeni. Kot vhodni datoteki se uporabljata večkratna poravnava jedra iz Parsnp in najbolje ocenjeno drevo ML iz RAxML.
Končno, da bi potrdili dogodek reorganizacije, ki ga predlaga Gubbinsov cevovod, je bilo šest algoritmov, implementiranih v RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 in SiScan66), uporabljenih za večkratno poravnavo jedra Parsnp pri privzetih nastavitvah. Ugotovili smo, da morajo vsaj trije algoritmi, implementirani v RDP4, dosledno prikazovati pomemben signal za potrditev vsakega dogodka rekombinacije.
Glede na to, da tako programska oprema Gubbins kot RDP iščeta rekombinacijske signale s preverjanjem večkratnih poravnav jedra v oknu do 500 bp in s potrditvijo, da vključitev genov PE/PPE med de novo sestavljanjem ne bo motila najdenih rekombinacijskih signalov, se nadaljnja analiza izvede s preverjanjem homolinearnosti v bližini gena, ki identificira rekombinacijski dogodek. Sinlinearni zemljevid z uporabo celotnega genoma je bil zgrajen z uporabo MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) za izključitev lokalnih translokacij ali inverzij genoma. Poleg tega je bil celoten genom uporabljen za izvedbo analize homolinearnosti aminokislinskega zaporedja prek spletnega strežnika SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Poglobljena analiza nabora podatkov genoma, pridobljenih iz portugalskega sistema za večgostiteljsko tuberkulozo, je namenjena preverjanju polimorfizma genov, omenjenih v literaturi. Ti geni so 37, 38 in gen, ki kodira 3R, ki so ga predniki MTBC pridobili s komponentami sistema HGT (popravljanje, replikacija in rekombinacija DNK) 39. Za izračun genske raznolikosti in nukleotidne raznolikosti (π) ter vhodnega parametra Tajima's D nevtralnega testa uporabite ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) in DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/).
Pridobljeno je bilo filogenetsko drevo največje verjetnosti (ML), ki temelji na 69 izolatih Mycoplasma bovis in referenčnih genomih (slika 2A). V primerjavi z drevesi, ki temeljijo na enem samem genu ali na več lokusih, ta strategija omogoča generiranje močnejših dreves, ki ne zajamejo variabilnosti celotnega genoma in zato kažejo manjšo sposobnost razlikovanja med vrstami 68,69. Topološka struktura drevesa ML je običajno skladna s kompleksno klasifikacijo klonov. Genom Eu2 je združen v vejo, genom Af1 pa je prav tako združen (slika 2A). Rezultat je skladen tudi z znanim evolucijskim odnosom Mycobacterium bovis, torej obstaja velika razlika med članom Eu1 in skupino, ki jo sestavljajo vsi drugi klonski kompleksi in genomi, vendar klonski kompleks 30 ni določen. Majhno neskladje med klonskim kompleksom in razmerjem, opaženim na filogenetskem drevesu, je mogoče pojasniti z dejstvom, da je klonski kompleks opisan na podlagi specifičnih genomskih regij, medtem ko filogenetsko drevo temelji na več poravnavah osrednjih genomov, ki predstavljajo celoten genom.
Filogenetsko drevo največje verjetnosti (GTR) je zgrajeno na podlagi poravnave jedra genoma Mycobacterium bovis pred (A) in po (B) odstranitvi mesta rekombinacije. Barve vej predstavljajo klonski kompleks Mycobacterium bovis: Evropa 1 je vijolična, Evropa 2 je rdeča, Evropa 3 je modra, Afrika 1 je oranžna in Afrika 2 je zelena. Drevo je ukoreninjeno in narisano v merilu, dolžina vej pa je izmerjena kot nadomestitev za vsako mesto.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis je opisan kot klonsko razvit in večina dokazov, zbranih skozi leta, podpira idejo, da se tekoči dogodki HGT in rekombinacije ne bodo pojavili na zaznavni ravni MTBC15,17,18.
Prejšnje delo je pokazalo, da lahko pride do omejene rekombinacije med sevi MTBC20,21, medtem ko drugim ni uspelo identificirati merljivih dogodkov rekombinacije70,71. Ponovno razpravljajte o tem vprašanju s poudarkom na Mycobacterium bovis, ki se razlikuje od prejšnjega dela, ki je upoštevalo le Mycobacterium tuberculosis70,71; ali pa upoštevajte MTBC kot celoto, skoraj brez M. bovis, ki bi predstavljal 20; ali pa upoštevajte le restriktivne frakcije goveda. V naboru podatkov o mikobakterijah je v tem delu skupno 70 sevov, ki predstavljajo vse klonske komplekse, uporabljene za presejanje rekombinacije. Nabor podatkov je razvrščen glede na štiri kumulativne ravni: (1) člani Eu2, (2) vsi člani evropskega klonskega kompleksa (tj. Evropa), (3) evropski in afriški klonski kompleks (Eu + Af) in (4) celotne zbirke podatkov (vključno z genomi, ki niso vključeni v noben klonski kompleks, ki je že opisan).
Za nadaljnjo preučitev te hipoteze je bila izvedena mreža z deljeno dekompozicijo, s katero so ocenili odsotnost rekombinacijskih dogodkov med genomi, saj lahko ta metoda vizualizira predniško razmerje med posamezniki in prikaže nasprotujoče si filogenetske signale. Vsi štirje nabori podatkov v analizi so potrdili obstoj zank v omrežju (torej območij, ki se ne zbližajo v eno samo drevo), vendar test Phi nima statistične podpore (Eu2, p = 0,0956; Evropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; celoten nabor podatkov p = 0,2451), kar zagotavlja slabe dokaze za obstoj reorganizacijskih dogodkov (slika 3A-D).
V Evropi 2 genoma (n = 37) (A), evropski genomi (n = 44) (B), evropski in afriški genomi (n = 51) (C) in celoten nabor podatkov (n = 70) (D).
Po tej analizi in ob upoštevanju cikličnih opazovanj v vseh omrežjih je bil za rekonstrukcijo klonske linije in za dopolnitev ocene učinka rekombinacije na genom M. bovis uporabljen rekonstrukcijski algoritem, implementiran v Gubbinsovem cevovodu. Sklepamo o kumulativnem številu rekombinacijskih dogodkov, od katerih se je večina zgodila v terminalnih vejah (torej v enem samem genomu) (tabela 2). Ti kazalniki kažejo na doslednost celotnega nabora podatkov in kažejo, da je pogostost rekombinacijskih dogodkov 200- do 300-krat večja od pogostosti mutacij. Parameter rho/theta, ki predstavlja relativne stopnje rekombinacije in točkovnih mutacij na veji, se zdi med 0,0037 in 0,0056 (tabela 3). Nedavno objavljeno delo seva 38 M. bovis je pokazalo višjo vrednost rho/theta (rho/theta = 0,1) od tiste, pridobljene v tem naboru podatkov, vendar je delo Patanéja in sodelavcev uporabilo sestavljanje na podlagi referenc za sklepanje o parametrih rekombinacije. Postopkovna podrobnost zaradi postopka sestavljanja je bila povezana z obilico domnevnih rekombinacijskih dogodkov v terminalni veji.
Nato parameter r/m predstavlja razmerje raznolikosti rekombinacije in vnosa mutacij, njegova povprečna vrednost pa je med 0,025 in 0,037, kar kaže, da ima rekombinacija v primerjavi z mutacijami manjši skupni vpliv na genetsko raznolikost M. bovis (tabela 3). Za obsežno primerjavo je bila uporabljena podobna metoda za oceno parametra r/m za nabor podatkov MTBC, sestavljen iz 23 genomov, ki kaže povprečno vrednost 0,48620, medtem ko je za nabor podatkov 38 M. bovis Patanéja in sodelavcev povprečna vrednost 0,98. V prvi študiji sta bila v delo M. bovis vključena le dva od 23 genomov (M. bovis BCG in referenčni sev), zato je lahko dobljena vrednost pristranska zaradi prekomernega izražanja genoma M. tuberculosis. V drugem poročilu so bile analizirane populacije Mycobacterium bovis večinoma pridobljene iz Združenih držav Amerike in od živine gostiteljice. V nasprotju s tem je v našem naboru podatkov zastopanih več geografskih lokacij in gostiteljskih vrst, uporabljeni pa so tudi genomi, združeni v različne klonske komplekse z različnimi populacijsko-genetskimi značilnostmi, s čimer se doseže globlje in širše poznavanje populacije. Razlika povprečne vrednosti r/m, pridobljena z našim naborom podatkov, je skladna s konceptom, da se stopnja rekombinacije močno razlikuje med linijami, dodeljenimi isti taksonomski vrsti, zato ti rezultati kažejo, da lahko klonski kompleks M. bovis kaže razlike v rekombinaciji. Vpliv je prav tako takšen, kot ga predlagata Didelot in Maiden72. Kljub temu bo znatna razširitev tega nabora podatkov z vključitvijo večjega števila genomov M. bovis omogočila nadaljnjo razjasnitev te točke. Tako parametra r/m kot rho/theta kažeta variabilnost med vejami, ta rezultat pa je skladen s poročili o drugih bakterijskih vrstah72,73.
Končno, da bi potrdili dogodke reorganizacije, ki jih je identificiral Gubbinsov cevovod, je bilo v programski opremi RDP4 uporabljenih šest različnih algoritmov za neodvisno testiranje različnih več primerjav jedra. Globalno je manj kot polovica dogodkov, ki jih je identificiral Gubbins, bila potrjena z RDP4 (preglednici 4 in 5). Glede na celoten nabor podatkov so bili potrjeni trije dogodki rekombinacije, dva sta vključevala notranja vozlišča, drugi pa en sam genom v terminalni veji, za katero ni bilo mogoče dodeliti klonskih kompleksov (preglednici 4 in 5). Identifikacija dogodkov v terminalnih vejah lahko kaže na to, da rekombinacija v sodobnih sevih M. bovis še vedno poteka ali da je rezultat napačen70. V tej hipotetični regiji rekombinacije ima približno 20 % položajev nedefinirane nukleotide (N), kar vpliva na signal rekombinacije (dodatna slika 2). Poleg tega ta regija vpliva na gen rrs, ki kodira 16S ribosomsko RNA, za katero se pričakuje, da je zelo ohranjena, zato je ta domnevni signal rekombinacije lahko posledica napak v sekvenciranju ali napačne poravnave. Nato je bila izvedena celotna poravnava genoma med Mb0003 in Mycobacterium bovis AF2122/97 in potrjen je bil obstoj nedefiniranih nukleotidov in SNP-jev, zato morebitne težave, povezane z napačno poravnavo, niso bile posledica bioloških informacij, implementiranih v tem delu. Pojavile so se po učenju programa.
V rekombinacijskih regijah notranjih vozlišč niso našli vrzeli ali nedefiniranih nukleotidov (sliki 4 in 5). Kar zadeva ta dogodka, eden vsebuje samo genom Eu2 in vpliva na gen pks12, ki kodira možno poliketidno sintazo; drugi pa je registriran v genomu Eu1 in vpliva na gen narX, ki kodira možno nitratno reduktazo (tabela 4). Na splošno analiza rekombinacije kaže, da obstaja omejeno število rekombinacijskih fragmentov s statistično podporo, sklepani indikatorji pa kažejo, da ima rekombinacija majhen vpliv na linijo M. bovis. Pričakuje se, da bo signal rekombinacije nizek, vendar je pomembno ločiti pravi evolucijski signal od šuma v ozadju, kar je zahtevna naloga. Da bi zmanjšali signal šuma, ki ga povzročajo problemi sestavljanja na podlagi referenc in neusklajenosti 70, 71, so bili vsi ostali, razen celotnega genoma, sestavljeni iz nič, kakovost sestavljanja pa je bila preverjena in zagotovljena z analizo cevovoda QUAST (dodatna tabela 1). Poleg tega je bila izvedena vrsta dodatnih analiz za zagotovitev robustnosti in natančnosti celotne raziskave. Zato je bila kakovost sekvenciranja genov narX in pks12 ocenjena z branjem z kartiranjem proti Mycobacterium bovis AF2122/97. Priporočen položaj SNP v rekombinacijski regiji je bil potrjen z uporabo meril, omenjenih v poglavju o metodi (vsaj 20 odčitkov in frekvenca sprememb 0,9). Polimorfizem gena narX je bil v celoti potrjen v obeh genomih (Mb1792361 in Mb7240415; 2,3 %) in genomih genoma pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 in Mb12. Vendar pa pri genomu Mb2043 šest od osmih položajev ne izpolnjuje kriterija globine branja, ker SNP podpira največ 17 odčitkov, kar je pod določeno mejno vrednostjo 20. Zato je mogoče potrditi rekombinacijo šestih genomov (8,6 %) na tem mestu genoma (sliki 4 in 5).
Podrobna vizualizacija poravnave rekombinacijske regije nabora podatkov Mycobacterium bovis vpliva na gen narX, ki kodira morebitno nitratno reduktazo. V rekombinacijski regiji notranjih vozlišč niso našli vrzeli ali nedefiniranih nukleotidov. Ta poseben dogodek je bil registriran v genomu Eu1. Kakovost sekvenciranja gena narX je bila ocenjena z grafičnim prikazom odčitkov Mycobacterium bovis AF2122/97. Priporočeno lokacijo SNP v rekombinacijskem območju potrdite z uporabo meril, omenjenih v razdelku o metodi (vsaj 20 odčitkov in frekvenca sprememb 0,9). Polimorfizem gena narX je bil v celoti potrjen v genomih Mb1792361 in Mb7240415 (2,3 %).
Podrobna vizualizacija poravnave rekombinacijske regije nabora podatkov Mycoplasma bovis, ki vpliva na gen pks12. V rekombinacijski regiji notranjih vozlišč niso našli vrzeli ali nedefiniranih nukleotidov. Kar zadeva dogodek, ki vpliva na gen pks12, ki kodira morebitno poliketidno sintazo, vsebuje le genom Eu2. Kakovost sekvenciranja pks12 je bila ocenjena z branjem mapiranja Mycobacterium bovis AF2122/97. Priporočeno lokacijo SNP v rekombinacijskem območju potrdite z uporabo meril, omenjenih v razdelku o metodi (vsaj 20 odčitkov in frekvenca sprememb 0,9). Polimorfizmi genomov Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 in Mb1960 so bili v celoti potrjeni.
Geni PE in PPE imajo ponavljajoča se območja, ki jih sekvenciranje in preslikava Illumina zlahka napačno prebereta, zato se običajno izbrišejo iz bioinformatičnega poteka dela članov M. tuberculosis le pri uporabi strategije preslikave v zaporedje. Sklepanje o rekombinacijskih dogodkih, uporabljeno v tem delu, temelji na de novo sestavljanju brez filtriranja PE/PPE. Menimo, da so z uporabo treh različnih komplementarnih metod in algoritmov prek programske opreme SplitsTree, Gubbinsovega cevovoda in RDP4 uporabljene strategije robustne za obdelavo in filtriranje reorganiziranih območij, ki jih povzročajo signali napak. Vendar pa je bila, da bi izključili interferenco gena PE/PPE s programsko opremo Gubbins in RDP4 za identifikacijo grozdov SNP in s tem identifikacijo rekombinacijskih regij, za katere se domneva, da vplivajo na gena narX in pks12, preučena sosednja regija teh genov (dodatna slika 3–5). Pri M. bovis AF2122/97 je gen narX ločen z narK2 in Mb1764c, medtem ko je pks12 obdan z Mb2075c in Mb2073c (dodatna slika 3-5). Zemljevid, ustvarjen z uporabo sinlinearnega zemljevida MAUVE celotnega genoma, zagotavlja informacije o ohranjenosti in prerazporeditvi genskega zaporedja, saj prikazuje štiri kolinearne bloke in nobenih znakov translokacije ali inverzije genoma. Poleg tega je komplementacijska analiza z aminokislinskim zaporedjem dokazala homologijo v vseh celotnih genomih, v sosednjih regijah narX ali pks12 pa ni bilo najdenih PE/PPE. Pri narX ima en genom (Mb0030) nižjo oceno sinonimije, ker je bil gen narX identificiran kot dva fragmenta (fragmenta 1891 in 1890). Pri pks12 sta Mb0030 in Mb003 zaradi podobnosti pokazala nižje ocene silinearnosti, medtem ko je bil pks12 identificiran v dveh oziroma treh fragmentih, ki predstavljata različni domeni proteina (dodatna slika 3-5). Ob upoštevanju teh informacij in ker sta programska oprema Gubbins in RDP4 izvedli analizo in preverili večkratno poravnavo jedra največjih 500 bp v oknu, smo potrdili, da gen PE/PPE ne bo motil rekombinacijskega signala, ki vpliva na narX in pks12.
Čeprav se rekombinacijski signali, zaznani v tem naboru podatkov, lahko štejejo za rezidualne, drži, da rekombinacije pri M. bovis ni mogoče izključiti, zato bi morala biti še naprej predmet nadaljnjih analiz, v katerih se celotni genomi iz različnih epidemioloških scenarijev sekvencirajo do pomembnih.
Primerjava filogenetskih dreves ML, pridobljenih pred in po korekciji rekombinacije (slika 2A, B), ni povzročila pomembnih sprememb v ugotovljenem filogenetskem odnosu, sevi M. bovis pa so bili združeni v isto skupino.
Po preslikavi 42 na novo sekvenciranih odčitkov M. bovis z referenčnim genomom M. bovis AF2122/97 je bila pridobljena poravnava SNP, ki vsebuje 1816 polimorfnih položajev. Večina SNP-jev (87,1 %) se nahaja v kodirajoči regiji, prizadeti geni pa so označeni glede na funkcionalne kategorije, prikazane v Bovilistu (slika 6A, B). Ob upoštevanju skupnega števila genov v vsaki funkcionalni kategoriji so geni v kategoriji "presnova lipidov" pokazali več SNP-jev, sledili so jim geni v kategoriji "celična stena in celični procesi" ter "vmesni metabolizem in dihanje", kar kaže na to, da so v evoluciji M. bovis.
Hierarhična analiza nabora podatkov M. bovis iz Portugalske (n = 42). Skupno število registriranih SNP-jev in prizadetih genov za vsako funkcionalno kategorijo (A). Skupno število sinonimnih in nesinonimnih sprememb, registriranih po funkcionalni kategoriji (B).
Na svetovni ravni je povprečno razmerje dN/dS boljše od 1,5, kar kaže na globalni evolucijski pritisk, da se znebimo predniškega stanja, in predstavlja pozitiven (diverzificiran ali usmerjen) in/ali sproščen scenarij izbire čiščenja. V kategorijah "virulenca, razstrupljanje, prilagoditev", "vstavitvena zaporedja in fagi" ter "regulatorni proteini" je več kot dve tretjini SNP-jev nesinonimnih (slika 6B).
V vseh kategorijah so geni z več SNP-ji, kar ima za posledico povprečno stopnjo mutacij (torej povprečni SNP na gen) večjo od 1 (slika 6A). Pks12 (Mb2074c) s 15 SNP-ji in fas (Mb2553c) z 8 SNP-ji imata višje vrednosti mutacij. Oba gena sodelujeta pri presnovi maščobnih kislin. Gen pks kodira poliketidno sintazo (PKS), ki je večfunkcijski encim, ki sodeluje pri biosintezi lipidov v celični steni mikobakterij74,75. Ta gen kodira večfunkcijski polipeptid, ki sodeluje pri sintezi mikoketidov74,76. Gen fas sodeluje pri sintezi mikolne kisline. Oba gena igrata pomembno vlogo pri biosintezi celične stene v stiku z gostiteljem.
Za nadaljnjo preučitev evolucije bakterije Mycobacterium bovis sta bila analizirana dva sklopa specifičnih genov. Predhodno objavljena dela z uporabo metod sestave zaporedja in filogenetskih metod so identificirala gene, ki so jih predniki MTBC pridobili prek HGT pred diverzifikacijo37,38. Ti geni so navedeni v dodatni tabeli 2. Analizirana je bila porazdelitev SNP skupno 77 genov, ki so lahko povezani s HGT, in identificiranih je bilo 26 polimorfnih mest, ki so v večini primerov (78 %) povzročila nesinonimne (NS) spremembe (dodatna tabela 2). Prejšnje delo na genomu MTBC je pokazalo, da domnevna regija HGT kaže višje razmerje NS SNP v primerjavi s preostalim delom genoma. Če menimo, da so te rekombinacijske regije pridobili predniki MTBC in zato prekomerno predstavljajo starodavne polimorfizme, potem se pričakuje, da bo delež sinonimnih sprememb višji, ker se pričakuje, da bodo NS substitucije izločene z negativno selekcijo zaradi sprememb aminokislin, ki lahko spremenijo funkcijo proteina. Zato naši rezultati kažejo, da lahko funkcionalne posledice izvirajo iz zamenjave genov, podobnih HGT, kar odraža njihov pomen za dragoceno prilagodljivo genetsko raznolikost.
Vzporedno s to analizo so bili geni, ki kodirajo komponente sistema 3R (popravljanje, replikacija in rekombinacija DNK), temeljito pregledani v skladu s seznamom, ki so ga predhodno objavili dos Vultos in sodelavci (2008)39. Izmenjave identičnih fragmentov DNK ni mogoče neposredno opazovati, čeprav je to lahko pogost proces, ko gre za tesno sorodne bakterije, kot je v primeru tega nabora podatkov; poleg tega je ta proces lahko ključ do metod popravljanja DNK72, zato igrajo vlogo pri homologni rekombinaciji. Skupno je bilo identificiranih 26 polimorfnih položajev, ki jih je porazdelilo 54 genov (dodatna tabela 3). V tem naboru genov so spremembe NS predstavljale približno 65 % posledic, kar je skladno s prejšnjimi poročili o sevih Mycobacterium tuberculosis.
Čas objave: 21. oktober 2021