Asante kwa kutembelea Nature. Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie toleo jipya zaidi la kivinjari (au zima hali ya uoanifu katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti zisizo na mitindo na JavaScript.
Mfuatano wa jenomu umehuisha nyanja ya utafiti wa magonjwa ya kuambukiza, kufichua epidemiolojia ya magonjwa, pathogenesis, mwingiliano wa pathojeni mwenyeji, na mchakato wa mageuzi uliowekwa kwa vimelea. Kifua kikuu cha Mycobacterium (MTBC) kinachukulia Mycobacterium bovis kama mmoja wa washiriki wake wa kuzoea wanyama ambao husababisha kifua kikuu (TB) kwa mamalia wa nchi kavu, na ni mfano wa kawaida wa mabadiliko ya bakteria. Kama washiriki wengine wa MTBC, Mycobacterium bovis inachukuliwa kuwa kisababishi magonjwa kilichoundwa kikamilifu, kinachoendelea polepole, na ni wazi hakuna dalili ya kuunganishwa tena au uhamisho wa jeni mlalo. Katika kazi hii, tunatumia jeni linganishi kwa mkusanyiko mzima wa mfuatano wa jenomu (WGS) unaojumuisha ng'ombe 70 M. kutoka asili tofauti (Ulaya na Afrika) ili kupata maarifa kuhusu aina mbalimbali za kijeni za ng'ombe M. Evolutionary power. Njia tatu tofauti hutumiwa kukadiria ishara za kupanga upya. Ulimwenguni, idadi ndogo ya matukio ya kuunganishwa tena yametambuliwa na kuthibitishwa na mbinu mbili za kujitegemea na usaidizi thabiti. Walakini, ikilinganishwa na mabadiliko, ujumuishaji upya una athari dhaifu kwa anuwai ya M. bovis (jumla r/m = 0.037). Tofauti ya wastani ya r/m inayopatikana katika konoli changamani ya Mycobacterium bovis katika seti yetu ya data inalingana na dhana ya jumla kwamba kiwango cha muunganisho kinaweza kutofautiana sana kati ya nasaba zilizogawiwa spishi zile zile za taxonomic. Kulingana na kazi hii, ujumuishaji upya katika Mycobacterium bovis hauwezi kutengwa, kwa hivyo inapaswa kuwa somo la juhudi zaidi katika utafiti wa linganishi wa jeni wa siku zijazo, ambapo WGS ya seti kubwa za data kutoka kwa matukio tofauti ya epidemiological duniani kote ni muhimu. Kisha uchambuzi wa ziada ulifanyika kwenye seti ndogo ya data ya Mycobacterium bovis (n = 42) kutoka kwa maambukizi ya kifua kikuu cha watu wengi, na zaidi ya loci 1,800 zilitambuliwa, ambapo angalau aina moja ilionyesha polymorphism ya nyukleotidi (SNP) . Nyingi (87.1%) ziko katika eneo la usimbaji, na uwiano wa kimataifa wa mabadiliko yasiyo ya visawe (dN/dS) ya mabadiliko ya visawe huzidi 1.5, ikionyesha kwamba uteuzi chanya ni nguvu muhimu ya mageuzi inayotekelezwa kwa M. bovis. Sehemu ya juu ya SNPs ziligunduliwa katika jeni zilizojaa kategoria za kazi za "lipid metabolism", "ukuta wa seli na michakato ya seli", na "metaboli ya kati na kupumua", ikionyesha uwezo wao katika biolojia na mageuzi ya umuhimu wa Mycobacterium bovis. Uangalizi wa karibu wa jeni katika mababu za MTBC ambazo zinakabiliwa na uhamisho wa jeni mlalo na kujumuishwa katika mfumo wa 3R (urekebishaji wa DNA, urudufishaji na ujumuishaji upya) unaonyesha wastani wa thamani hasi wa kimataifa wa jaribio la kutoegemeza la Taijima la D, ambalo linaonyesha uchanganuzi wa siku za nyuma Ukiukaji wa hivi majuzi baada ya upanuzi wa idadi ya watu bado ni sababu kuu ya mageuzi ya pathojeni ya jeshi la bakteria.
Kifua kikuu cha Mycobacterium (MTBC) ni mojawapo ya taksi zilizofanikiwa zaidi za vimelea vya bakteria na kesi ya kawaida ya mabadiliko ya bakteria. Wanachama wake wanaonyesha utambulisho wa juu wa nyukleotidi katika kiwango cha jeni (> 99%)1,2. Aina tofauti za ikolojia za MTBC zinaweza kusababisha ugonjwa wa kifua kikuu (TB), ambao ni ugonjwa wa kuambukiza wa granulomatous, katika anuwai ya spishi mwenyeji kutoka kwa mamalia wadogo hadi wanadamu3,4,5. Hivi sasa, tata hiyo inajumuisha wanadamu [M. Kifua kikuu (Mtb), Mycobacterium africanum] na vimelea vinavyobadilika kwa wanyama (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter , Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus sokwe") 5,6 "sokwe". M. canettii (pia inajulikana kama "Nodobacter glabrata") Utambulisho wa wastani wa nyukleotidi na mycobacteria iliyotajwa hapo juu ni 98%, na kazi linganishi ya jenomics imeonyesha kuwa M. canettii na wengine wa MTBC wametofautiana hivi karibuni na babu wa kawaida.7 Kwa kuzingatia dhana hii, baadhi ya waandishi huita MT Mwanachama wa 8 M.
MTBC inafafanuliwa kwa utaratibu kuwa changamano kali, na muundo wake wa idadi ya watu hutawaliwa kwa uwazi na utofauti uliopunguzwa, vikwazo, uchanganuzi wa kuchagua, na jeni drift9,10. Kwa kuchukulia mageuzi changamano ya kaloni, kama vile upolimishaji zinazokosekana haziwezi kurejeshwa kwa kuunganishwa tena. Kulingana na msingi huu, matukio mfululizo ya ufutaji wa jeni wa eneo tofauti (RD) na TbD1 (eneo maalum la Mtb la kufuta 1) yamependekezwa kama viashirio vya molekuli za mageuzi ya MTBC2,5,11. Kazi ya ulinganishi wa jeni na mpangilio mzima wa jenomu (WGS) inasaidia mgawanyiko wa washiriki waliobadilishwa na binadamu katika safu tisa (Mycobacterium tuberculosis L1 hadi L4, L7, na L8; na Mycobacterium africanum L5, L6, na L9), safu za L2 hadi L4 zilizoshirikiwa futa TbD1 kanda22,1. Kwa kuongezea, washiriki waliobadilishwa wanyama wanapendekezwa kushiriki babu moja, ambayo inafafanuliwa na ufutaji maalum wa clade katika RD7, RD8, RD9 na RD102, 5, na 14.
Uhamisho wa jeni mlalo (HGT) na matukio ya ujumuishaji upya huchukuliwa kuwa nadra na hutokea kwa mababu wa MTBC, badala ya historia tofauti ya mwanachama mzima wa MTBC15,16,17. Ripoti mbili za awali za Hughes na washirika (2002) na Gutacker na washirika (2006) zilipendekeza kuwa matukio ya upatanisho yanaweza kusaidia kuunda polimafimu zinazoashiria loci maalum katika aina ya kifua kikuu ya M.18,19. Sababu za kukosekana kwa ujumuishaji wa wazi katika MTBC ni: (1) mchakato wa mitambo na upotezaji wa uwezo wa HGT; (2) uhaba wa matukio ya HGT; (3) hakuna nafasi ya matukio ya kuunganisha upya katika niche ya MTBC14,17. Hivi majuzi, baadhi ya tafiti za mpangilio wa jenasi nzima (WGS) zilizotumika kwa aina ya MTBC 20 na Mycobacterium bovis 21 zimetoa ushahidi wa kuunganishwa tena, uchunguzi wa kwanza kuonyesha kwamba aina za MTBC mara nyingi hubadilishana vipande vidogo vya DNA, lakini kutokana na tofauti ndogo ya mfuatano wa nyukleotidi, matukio haya bado hayajatambuliwa.
Mycobacterium bovis ndiye mwanachama anayepatikana zaidi wa MTBC kutoka kwa mifugo (hasa ng'ombe), ingawa inaweza pia kutengwa kutoka kwa wanyama wa porini waliohifadhiwa bure na waliozungushiwa uzio4,22,23,24. M. bovis ilibadilika na kuwa aina tano kuu za clonal [Ulaya 1 (Eu1), Ulaya 2 (Eu2), Ulaya 3 (Eu3), Kiafrika 1 (Af1) na Afrika 2 (Af2)], kulingana na wasifu wa spoligotyping, ufutaji mahususi Na polimafimu za nukleotidi moja (SNPs) 25, 27, 26, jeni mahususi. Konoli hizi zinaonyesha muundo tofauti wa idadi ya bovis ya Mycobacterium na uhusiano wake na maeneo ya kijiografia. Kwa kuongezea, kazi ya hivi majuzi ya WGS iliyofanywa na Zimpel na washiriki (2020) ilibuni filojeni kulingana na SNP ya Mycobacterium bovis, yenye zaidi ya jenomu 1,900, ikionyesha kwamba kuna angalau nasaba nne tofauti (zinazoitwa Lb1 hadi Lb1 hadi Lb4), hazifanani kabisa na ugumu wa kijiografia, ingawa hapo awali haziendani kabisa na ugumu wa kijiografia. Waandishi hawa walifanya uchanganuzi wa kutofautisha wa phylogeny na uchumba wa molekuli, lakini hawakusoma recombination30.
Kazi ya awali kwa kutumia mbinu tofauti za molekuli, kama vile spoligotyping, MIRU-VNTR (nambari ya kurudia ya nambari inayobadilika-tofautiana ya mycobacterial iliyoingiliana), na uchapaji wa hivi majuzi wa SNP ulifichua kiwango fulani cha utofauti wa kijeni kati ya aina za M. bovis 31,32,33, 34,35. Utofautishaji wa tofauti za kijeni umekuwa nyenzo muhimu katika utafiti wa epidemiolojia ya magonjwa, ambayo inasaidia kwa uelewa wa kina wa pathogenesis, virusi na maambukizi ya magonjwa. Kuibuka kwa mbinu ya WGS kunatoa uwezekano wa kufichua sababu za mageuzi za kuendesha gari zilizowekwa na genome ya Mycobacterium bovis katika mchakato wa kukabiliana na kuendelea kwa majeshi tofauti na matukio ya epidemiological.
Katika kazi hii, tunatumia uchanganuzi linganishi wa jeni kwenye hifadhidata mbalimbali za Mycoplasma bovis (n=70), ikijumuisha vitenganishi kutoka kwa miundo tofauti ya clonal, ili kupata maarifa kuhusu mchakato wa mageuzi wa Mycoplasma bovis, hasa kutatua mahusiano ya filojenetiki Na matukio ya kuchanganya tena. Kama nyongeza ya uchanganuzi huu, seti ndogo ya data ya M. bovis hutenga (n = 42) iliyopatikana kutoka eneo lenye sifa nzuri la kifua kikuu chenye mwenyeji nchini Ureno 31,36 ilichunguzwa zaidi ili kubaini kutotambulika Usawa kati ya uwiano wa jamaa wa maana (dN) hadi kisawe (dS) nukleotidi ya eneo hilo, na vile vile vibadala vilivyotajwa katika fasihi. 37,38 zilizopatikana na mababu wa MTBC kupitia HGT, na kusimba 3R (urekebishaji wa DNA, urudiaji, na ujumuishaji upya) vipengele vya jeni vya mfumo 39. Chagua jeni zilizopatikana kupitia HGT kwa sababu zinaweza kuwakilisha upolimishaji wa zamani, kwa hivyo inatarajiwa kuwa zinaweza kuwa na sehemu kubwa zaidi ya mabadiliko sawa. Jeni zilizojumuishwa katika mfumo wa 3R zilichaguliwa kwa sababu kazi ya awali juu ya aina ya kifua kikuu cha M. ilionyesha uteuzi wa jumla hasi / utakaso unaofanya kazi kwenye jeni hizi, na wanaweza kuwa na jukumu muhimu katika mageuzi 39. Lengo lingine la kazi hii ni kukisia kuwepo kwa matukio ya kupanga upya. Kwa sababu hii, kwa kuzingatia kuwa mkusanyiko wetu wa data kutoka Ureno una jenomu za mwamba wa clone 2 pekee na aina ambazo hazijakabidhi mchanganyiko wa clone, tuliamua kujumuisha data ya jenomu inayopatikana kwa umma ili hatimaye kupata mwakilishi wa aina zote za clone, na Kuboresha uthabiti na upana wa matokeo.
42 Mycoplasma bovis genomes zilizofuatana hivi karibuni kutoka eneo la ugonjwa wa kifua kikuu wenye asili ya Ureno (maelezo hapa chini), yaliyoainishwa hapo awali kutoka kwa mtazamo wa magonjwa36, ndio kiini cha kazi hii. Kwa kuzingatia kwamba data kutoka Ureno ina wawakilishi wa aina mbili za koni za Ulaya pekee na aina zisizo na muundo maalum, data inayopatikana hadharani ya mpangilio wa jenomu nzima imeongezwa ili kupanua seti ya data inayojumuisha wawakilishi wote wa muundo wa clone wa M. bovis. Kwa hiyo, vyanzo vitatu vya data vya mpangilio wa jenomu zima vilitumika katika kazi hii: mkusanyiko kamili/rasimu ya jenomu, hadi scaffolds 10 zilizohifadhiwa katika NCBI (Kituo cha Taifa cha Taarifa za Bioteknolojia) (n = 15 hutenga); iliyohifadhiwa katika SRA ( Faili ya Illumina fastq ya hifadhi ya mfuatano iliyosomwa) inawakilisha utofauti changamano wa kloni za M. bovis (n = 12 hutenga)30; na jenomu 42 zilizopangwa upya kutoka Ureno. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) haikujumuishwa kwenye utafutaji wa NCBI. M. bovis AF2122/97 kwa kawaida hutumiwa kama jenomu ya marejeleo itakayojumuishwa kwenye mkusanyiko wa data. Kutokana na kutopatikana kwa umma kwa mfuatano mzima wa jenomu unaowakilishwa na muungano wa uundaji 1 wa Kiafrika, na idadi ndogo ya jenomu kutoka kwa aina wakilishi za Af2 na Eu1, data ya awali ya mfuatano iliyotolewa na SRA ilitumiwa katika visa hivi. Kazi ya Zimpel na washirika wake (2020) ilisaidia kutambua jenomu kutoka kwa tata ya uundaji iliyotajwa hapo juu na ilisaidia kuchagua Mycobacterium bovis ili kujumuishwa katika seti ya data. Kwa Eu3, ni aina moja tu ya jenomu iliyoelezewa (Branger et al., 2020), kwa hivyo jenomu tunayojumuisha ni mwakilishi tofauti wa tata ya Eu3.
Ulimwenguni, seti hii ya data inajumuisha ng'ombe 70 wa M. bovis waliotengwa kutoka kwa spishi 8 za mwenyeji, zilizosambazwa katika nchi 12 kutoka 1985 hadi 2016. Spishi 36 zimeteuliwa kama Eu2, spishi 7 ni Eu1, spishi 1 ni Eu3, spishi 3 ni Af1, spishi 4 ni Af2 na spishi 19 haziko chini ya mkia (hazina uhusiano wowote na mkia). Maelezo ya kina (pamoja na nambari ya kujiunga) ya Mycobacterium bovis iliyotumiwa katika utafiti huu imeonyeshwa katika Jedwali la 1 na Jedwali la Ziada la 1.
Jenasi 42 mpya zilizofuatana za Mycobacterium bovis kutoka maeneo hatarishi ya kifua kikuu cha wanyama nchini Ureno na kusambazwa kwa zaidi ya miaka 12 ndizo kitovu cha utafiti huu, kwani mifumo inayoweza kutokea ya magonjwa ya wanyamapori imefuatiliwa mara kwa mara 31,36 (Mchoro wa Nyongeza. 1). Kulingana na taratibu zilizofuata, aina hizi zilitengwa kutoka kwa ng'ombe (n = 14), kulungu nyekundu (n = 16) na nguruwe pori (n = 12) kutoka 2003 hadi 2015: kukusanya na kushughulikia wanyama kwa mujibu wa miongozo ya itifaki iliyopendekezwa Sampuli za tishu ziko kwenye Kitabu cha OIE Terrestrial Animal Handbook na kuingizwa kwenye kioevu cha Stonewebrinkstein na chandaruwe ya kioevu cha Stonewen kati. Tamaduni huamilishwa kwa 37 ° C na ukuaji huangaliwa mara moja kwa wiki kwa angalau wiki 12. Makoloni huhifadhiwa moja kwa moja kwenye suluhisho la glycerol kwa -80ºC. Katika mbinu ya kuchagua ya Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), sampuli asili zilizohifadhiwa kwenye kumbukumbu zilipitishwa kupitia kifungu kimoja cha in vitro in vitro ili kupata DNA ya programu ya WGS. Kwa hili, suluhu ya hisa iliyogandishwa iliimarishwa kwa 5% sodium pyruvate na 10% ADS (50 g albumin, 20 g glucose, 8.5 g sodium chloride katika lita 1 ya maji) kwenye Middlebrook 7H9 saa 37°C Retrain. Baada ya wiki 4 za ukuaji, kati ilifanywa upya na utamaduni ulifuatiliwa mara kwa mara mpaka ukuaji ulionekana. Seli zilivunwa kwa kuainishwa, pellet ilisimamishwa tena katika saline 500 µL phosphate buffered saline (PBS), kupashwa joto kwa 99 °C kwa dakika 30, centrifuged, na supernatant ilihifadhiwa katika -20 °C hadi WGS. Taratibu zote zinafanywa katika vituo vya usalama wa viumbe vya ngazi ya 3.
Maktaba ya genome ya WGS yenye mwisho wa jozi hutayarishwa kwa kutumia kielezo cha kipekee cha kila sampuli ya DNA, na hutumia teknolojia ya Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (sampuli 40) na HiSeq (2 × 150 pb) (mbili pekee) (Eurofins Genomics, Ujerumani) kupanga mfuatano. Kulingana na maagizo ya mtengenezaji, tumia Kichanganuzi cha Genome cha Illumina chenye kiambatisho cha moduli yenye viingilio viwili ili kupanga DNA ya jenomu, na utumie Kifaa cha Maandalizi cha Maktaba ya Nextera XT DNA kutoka Illumina kuunda maktaba.
Kwa kuzingatia data iliyopatikana kutoka kwa SRA (n = 12), kitambulisho cha mchanganyiko wa clone kinaweza kutumika kama metadata ya uchapishaji sambamba 30, 41, 43. Wakati wa kuzingatia jenomu kamili, isipokuwa kwa Mycobacterium bovis AF2122/97 na Mycobacterium bovis 3601, ambayo ni wanachama wa Eunal 3 na Eunal 5 wanaotambuliwa. 29, kwa mtiririko huo, ni sawa na genome kamili ya Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI accession number NC_000962.3). Mpangilio wa jenomu unafanywa kwa kutumia MAFFT (mpango wa upatanishi mwingi wa asidi ya amino au mlolongo wa nyukleotidi, toleo la 7.458) na parameta -addfragments48. Kisha, tafuta kutokuwepo kwa aina tofauti za clonal na/au uwepo wa vipengele vya SNP.
Mycobacterium bovis iliyofuatana upya (n = 42) na usomaji wa awali wa rasimu ya jenomu iliyokusanywa (n = 3) inalinganisha changamano na jenomu ya kumbukumbu ya Mycobacterium tuberculosis H37Rv kupitia bomba la vSNP na uwepo wa ufutaji na/au vipengele vya SNP vya kloni tofauti Utafutaji ulifanyika.
Kusanya taarifa kutokana na kukosekana kwa vipengele na/au kuwepo/kutokuwepo kwa SNP na wasifu wa uchapaji spoligoti ili kugawa data ya kinasaba kwa koni tata inayolingana. Kwa makusanyiko manne ya rasimu, wasifu wa spoligotyping hauwezi kukisiwa, kwa hivyo umejumuishwa katika kikundi cha "hakuna utata".
Mtiririko wa kazi wa bioinformatics unaofuatwa na kazi hii huanza kutoka mkusanyiko wa de novo na uchoraji ramani hadi mkakati wa marejeleo, kwa lengo la kuchunguza matukio ya ujumuishaji upya na upolimishaji mahususi wa genomu. Kielelezo cha 1 kinatoa mtiririko wa hatua zinazofuatwa. Kwa uchanganuzi wa ujumuishaji upya, jenomu zote hutumiwa kuongeza uthabiti wa makisio na viashirio vinavyohusiana.
Ili kupunguza makosa katika uundaji wa mfuatano wa makubaliano ya genome, kwanza tulipata mkusanyiko wa de novo, na kisha tukapata upatanishi wa msingi mwingi. Bomba la Unicycler kwa sasa linapatikana katika https://github.com/rrwick/Unicycler49 na hutumiwa kufanya mkusanyiko mpya wa jenomu 54 zilizofuatana (42 zilizopangwa upya na faili 12 za fastq zilizopatikana kutoka kwa SRA). Kwa kifupi, kabla ya kukusanyika kutoka mwanzo, uchanganuzi wa ubora wa kusoma ulifanywa katika toleo la FastQC la 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), na toleo la Trimmomatic 0.36 (chaguo "kukata Adapta na mlolongo mwingine maalum wa mwanga kutoka kwa usomaji" na "Kata besi 2, kushikilia 0" ikiwa ni chini ya ubora wa 0. kutumika) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Kisha, SPAdes optimiser49 ilitumiwa kwa kuunganisha jenomu, na toleo la Pilon 1.1851 lilitumika kwa uboreshaji wa baada ya mkusanyiko. Njia ya kihafidhina ya kuweka daraja ilichaguliwa ili kuzuia mkusanyiko usio sahihi, na saizi ya k-mer ilitafutwa na kuchaguliwa kati ya 20% na 95% ya urefu uliosomwa. Fuata miongozo ya SPAdes na uzingatie ukubwa wa kusoma, futa contigs ndogo kuliko 300 bp, na uweke sehemu 20 ya kukatika kwa kina cha 52. Katika mkakati wa mkusanyiko wa de novo, maeneo ya genomic kama vile proline-glutamate (PE) na paralogi za proline-proline glutamate (PPE) hazikuondolewa.
Ubora wa mkusanyiko wa de novo unatathminiwa kupitia bomba la QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), ambalo hurahisisha usasishaji wa contig na jenomu ya marejeleo ya M. bovis AF2122/97 (Nambari ya nyongeza ya NCBI LT708304.1) Kuchora (angalia Jedwali la Ziada la 1).
Kwa usaidizi wa bomba la vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), faili ya FASTQ ya mpangilio mpya wa M. bovis kutoka kwa Illumina inalinganishwa na jenomu ya marejeleo ya M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Kulingana na mapendekezo ya utendaji bora wa Zana ya Uchambuzi wa Jeni (GATK) 53, 54, 55 tumia vigezo vya kawaida vya kichujio au alama za molekuli za lahaja kwa urekebishaji upya. Matokeo yanachujwa kwa kutumia alama ya chini kabisa ya SAMtools ya 150 na AC = 2. Pia tumia Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) kuangalia usomaji ili kuzuia uchafuzi. Bomba la vSNP linalotumiwa kupanga mikakati ya kupanga mikakati katika kazi yetu huchunguza mfululizo wa SNP na shabaha zilizobainishwa, na pia haijumuishi matukio mchanganyiko ya maambukizi. Chanjo ya jenomu iliyosomwa ni bora kuliko 99% (Jedwali la Nyongeza 1).
Ili kuepuka hitilafu za ramani na SNP zisizo sahihi, chuja lahaja katika hali zifuatazo: (1) inaungwa mkono na usomaji chini ya 20, (2) hupatikana kwa marudio ya chini ya 0.9, (3) iko katika angalau Matatizo moja, lakini angalau kuna mapungufu katika aina nyingine. Toleo la 2.4.19 la kitazamaji cha genomics (IGV) 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 lilitumika kuthibitisha SNP na misimamo yenye matatizo ya ramani au upatanishi. Kwa kuwa jeni za proline-glutamate (PE) na proline-proline glutamate (PPE) zimerudiwa sana na ni sehemu ya familia yenye jeni nyingi, hazieleweki kwa urahisi na mpangilio wa Illumina na upotoshaji, kwa hivyo zinapendelewa Mtiririko wa kazi wa mycobacterial bioinformatics uliondoa wanachama wa tata ya kifua kikuu wakati wa kutumia mkakati wa mfuatano wa kuchora ramani ya SNP. Kwa hivyo, tulichuja jeni na indels za PE/PPE kutoka kwa uchanganuzi.
Kulingana na Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), SNP zote zimegawanywa katika kategoria za utendaji. Bomba la SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) hutumika kuashiria matokeo ya SNP (mabadiliko ya visawe au yasiyo ya kisawe). Imeunda hifadhidata mpya ya Mycobacterium bovis AF2122/97 genome (LT708304.1).
Upangaji mwingi wa msingi wa jenomu ulifanywa kwa kutumia Parsnp v1.2, inayopatikana kwa sasa katika https://github.com/marbl/parsnp57, kwa kutumia mikusanyiko 69 kamili ya genomes/draft (pamoja na chaguo -c) na M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) inatumika kama marejeleo. Mipangilio minne ya msingi mingi ilifanywa: wanachama pekee wa mchanganyiko wa cloning wa Eu2 (n = 37), ikiwa ni pamoja na wanachama wote wa tata ya cloning ya Ulaya (n = 44), ikiwa ni pamoja na hatua ya makutano ya tata ya cloning ya Ulaya na Afrika (n = 51), na inajumuisha bovis zote za Mycobacterium katika utafiti huu (n = 70).
Mpangilio wa kimsingi unaozalishwa na Parsnp hutumika kukadiria uwezekano wa juu kabisa (ML) wa mti wa filojenetiki kwa kutumia CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 kwa kutumia RAxML, na kutekeleza marudio 1000 yaliyoongozwa.
Zana tatu tofauti za algoriti na habari za kibayolojia hutumika kuangalia uwepo wa matukio ya ujumuishaji upya kwa sambamba: programu ya SplitsTree4, Gubbins (nasaba isiyo na upendeleo kupitia ujumuishaji upya katika mfuatano wa nyukleotidi) na RDP4 (mpango wa kutambua upya, toleo la beta 4.101).
Mbinu ya mtengano wa mgawanyiko iliyotekelezwa katika SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 inatumika kukokotoa mtandao wa filojenetiki usio na mizizi, kwa kutumia jaribio la Phi kwa uthibitishaji wa takwimu, na kiwango cha juu cha umuhimu ni p = 0.05. Uchanganuzi wa msingi wa upatanishi mwingi wa Parsnp hutumiwa kama ingizo, na mtengano wa mgawanyiko kama kiwango cha mtandao unatekelezwa.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 inaendeshwa na vigezo chaguo-msingi kama njia nyingine ya kutathmini athari ya muunganisho upya kwenye Mycobacterium bovis. Kanuni inayotekelezwa katika bomba inaunda upya ukoo wa clone husika Genome/rasimu kamili ya mkusanyiko wa seti yetu ya data2 bovid2 AF2vine na rejeleo la 9 LT708304.1) ziko pande zote mbili; na uchanganue nafasi ya SNP kwenye kila tawi la mti ili kugundua nguzo ya SNP inayowakilisha tukio la ujumuishaji upya. Chukulia kuwa hakuna tukio la ujumuishaji upya, ambayo ina maana kwamba SNP zinazotokea kwenye tawi zinapaswa kusambazwa sawasawa kutoka kwa upangaji wa alama za ParRAxML.
Hatimaye, ili kuthibitisha tukio la kupanga upya lililopendekezwa na bomba la Gubbins, algoriti sita zilizotekelezwa katika RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 na SiScan66) zinatumika kwa upatanishi wa msingi wa Parsnp chini ya mipangilio chaguomsingi. Tuliamua kuwa angalau algoriti tatu zilizotekelezwa katika RDP4 lazima zionyeshe mara kwa mara ishara muhimu ili kuthibitisha kila tukio la kuchanganya upya.
Kwa kuzingatia kwamba programu zote mbili za Gubbins na RDP hutafuta ishara za ujumuishaji upya kwa kuangalia mipangilio mingi ya msingi kwenye dirisha la hadi 500 bp, na kuthibitisha kuwa ujumuishaji wa jeni za PE/PPE wakati wa mkusanyiko wa de novo hautaingiliana na ishara za ujumuishaji zilizopatikana, uchambuzi zaidi unafanywa kwa usawa. Ramani ya synlinear inayotumia jenomu kamili iliundwa kwa upatanishi wa MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ili kuwatenga uhamishaji wa jenomu za ndani au ubadilishaji. Zaidi ya hayo, jenomu nzima ilitumika kufanya uchanganuzi wa usawa kwenye mfuatano wa asidi ya amino kupitia seva ya wavuti ya SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Uchambuzi wa kina zaidi wa seti ya data ya jenomu iliyopatikana kutoka kwa mfumo wa kifua kikuu wenye mwenyeji wengi wa Ureno ni kuangalia upolimishaji wa jeni zilizotajwa katika maandiko. Jeni hizi ni 37,38 na jeni inayosimba 3R iliyopatikana na mababu wa MTBC kupitia vipengele vya mfumo wa HGT (urekebishaji wa DNA, urudufishaji na ujumuishaji upya) 39. Tumia ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) na utumie DnaSP v6.12.03 (http://u/dub diversal na hesabu). uanuwai wa nyukleotidi (π) na uingizaji wa kigezo cha kigezo cha kipimo cha D cha Tajima.
Uwezekano mkubwa zaidi wa mti wa filojenetiki (ML) kulingana na 69 Mycoplasma bovis hutenga na genome za kumbukumbu zilipatikana (Mchoro 2A). Ikilinganishwa na miti yenye jeni moja au miti yenye locus nyingi, mkakati huu unaruhusu uzalishaji wa miti yenye nguvu zaidi ambayo haichukui utofauti wa jenomu nzima na hivyo kuonyesha uwezo mdogo wa kubagua kati ya spishi 68,69. Muundo wa kitopolojia wa mti wa ML kawaida hulingana na uainishaji changamano wa kloni. Jenomu ya Eu2 imeunganishwa katika tawi, na jenomu ya Af1 pia imeunganishwa pamoja (Mchoro 2A). Matokeo yake pia yanawiana na uhusiano unaojulikana wa mageuzi wa Mycobacterium bovis, yaani, kuna tofauti kubwa kati ya mwanachama wa Eu1 na kundi linalojumuisha kolonali na jenomu zingine zote, lakini changamano 30 haijabainishwa. Utofauti mdogo kati ya changamano ya kloni na uhusiano unaozingatiwa kwenye mti wa filojenetiki unaweza kuelezewa na ukweli kwamba tata ya clonal inaelezewa kulingana na maeneo maalum ya genomic, wakati mti wa phylogenetic unategemea alignments nyingi za jenomu za msingi zinazowakilisha genome nzima.
Uwezekano mkubwa zaidi wa mti wa filojenetiki (GTR) umeundwa kwa kuzingatia upatanishi wa msingi wa jenomu ya Mycobacterium bovis genome kabla ya (A) na baada ya (B) kuondolewa kwa tovuti ya muunganisho. Rangi za tawi zinawakilisha mchanganyiko wa Mycobacterium bovis clone: Ulaya 1 ni zambarau, Ulaya 2 ni nyekundu, Ulaya 3 ni bluu, Afrika 1 ni machungwa, na Afrika 2 ni ya kijani. Mti umekita mizizi na kuvutwa kwa mizani, na urefu wa tawi hupimwa kama uingizwaji wa kila tovuti.
Kifua kikuu cha Mycobacterium kinafafanuliwa kuwa kilizuka kwa kishindo, na ushahidi mwingi uliokusanywa kwa miaka mingi unaunga mkono wazo kwamba matukio yanayoendelea ya HGT na ujumuishaji upya hayatatokea katika kiwango kinachoweza kutambulika cha MTBC15,17,18.
Kazi ya awali imeonyesha kuwa kunaweza kuwa na ujumuishaji mdogo kati ya aina za MTBC20,21, huku zingine zimeshindwa kutambua matukio ya ujumuishaji yanayoweza kupimika70,71. Jadili tena suala hili kwa kuzingatia Mycobacterium bovis, ambayo ni tofauti na kazi ya awali ambayo ilizingatia tu kifua kikuu cha Mycobacterium 70,71; au fikiria MTBC kwa ujumla, bila karibu M. bovis anayewakilisha 20; au fikiria tu sehemu za ng'ombe zenye vizuizi. Seti ya data ya mycobacteria, katika kazi hii, kuna jumla ya aina 70, zinazowakilisha aina zote za clonal, zinazotumiwa kuchuja ili kuunganishwa tena. Seti ya data hupimwa kulingana na viwango vinne vilivyojumlishwa: (1) Wanachama wa Eu2, (2) wanachama wote changamano wa Ulaya (yaani Ulaya), (3) Umoja wa Ulaya na Afrika (Eu + Af) na (4) Mikusanyiko yote ya data (ikiwa ni pamoja na jenomu ambazo hazijajumuishwa katika muundo wowote wa kloni ulioelezewa tayari).
Ili kujifunza zaidi nadharia hii, mtandao wa mtengano wa mgawanyiko ulifanyika ili kutathmini kutokuwepo kwa matukio ya kuchanganya upya kati ya jenomu, kwa sababu njia hii inaweza kuibua uhusiano wa mababu kati ya watu binafsi na kuonyesha ishara zinazopingana za phylogenetic. Seti zote nne za data katika uchanganuzi zilithibitisha kuwepo kwa vitanzi kwenye mtandao (yaani, maeneo ambayo hayaungani na kuwa mti mmoja), lakini jaribio la Phi halina usaidizi wa takwimu (Eu2, p = 0.0956; Ulaya, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; data nzima iliyowekwa p = 0.2, au 0.2 hutoa ushahidi duni wa matukio p = 0.2. 3A-D).
Katika Ulaya 2 jenomu (n = 37) (A), jenomu za Ulaya (n = 44) (B), jenomu za Ulaya na Afrika (n = 51) (C) na seti nzima ya data (n = 70) (D).
Baada ya uchanganuzi huu, na kwa kuzingatia uchunguzi wa mzunguko katika mitandao yote, kanuni ya uundaji upya iliyotekelezwa katika bomba la Gubbins ilitumiwa kuunda upya ukoo wa koloni na kuongeza makadirio ya athari ya muunganisho kwenye jenomu ya M. bovis. Chunguza idadi iliyojumlishwa ya matukio ya kuunganisha upya, ambayo mengi yalitokea katika matawi ya mwisho (yaani, katika jenomu moja) (Jedwali 2). Viashirio hivi vinaonyesha uthabiti wa seti nzima ya data na zinaonyesha kwamba mzunguko wa matukio ya kuchanganya upya ni mara 200 hadi 300 ya mabadiliko. Mara baada ya kigezo cha rho/theta kinachowakilisha viwango vya jamaa vya ujumuishaji upya na mabadiliko ya uhakika kwenye tawi inaonekana kuwa kati ya 0.0037 na 0.0056 (Jedwali 3). Hivi majuzi, kazi iliyochapishwa ya aina ya 38 M. bovis ilionyesha thamani ya juu ya rho/theta (rho/theta = 0.1) kuliko ile iliyopatikana katika mkusanyiko huu wa data, lakini kazi ya Patané na wenzake walitumia mkusanyiko wa msingi wa marejeleo ili kukagua vigezo vya ujumuishaji , Maelezo ya kiutaratibu, kwa sababu ya utaratibu wa mkusanyiko, yamehusishwa na mkusanyiko wa matukio mengi ya mwisho.
Kisha, kigezo cha r/m kinawakilisha uwiano wa uanuwai wa utangulizi wa ujumuishaji upya na mabadiliko, na thamani yake ya wastani ni kati ya 0.025 na 0.037, ikionyesha kwamba ikilinganishwa na mabadiliko, ujumuishaji upya una athari ya chini kwa jumla kwa anuwai ya kijeni ya M. bovis (Jedwali 3)). Kwa ulinganisho wa kina, mbinu sawia ilitumiwa kukadiria kigezo cha r/m cha mkusanyiko wa data wa MTBC unaojumuisha jenomu 23, inayoonyesha thamani ya wastani ya 0.48620, huku kwa seti ya data ya Patané na wenzake 38 M. bovis, ilithibitisha thamani ya wastani Ni 0.98. Katika utafiti wa kwanza, ni genome mbili tu kati ya 23 zilizojumuishwa katika kazi ya M. bovis (M. bovis BCG na shida ya kumbukumbu), kwa hivyo thamani iliyopatikana inaweza kuwa ya upendeleo kwa sababu ya udhihirisho mkubwa wa genome ya M. kifua kikuu. Katika ripoti ya pili, idadi ya bovis iliyochambuliwa ya Mycobacterium ilipatikana kutoka Marekani na wenyeji wa mifugo. Kinyume chake, katika seti yetu ya data, maeneo zaidi ya kijiografia na spishi mwenyeji huwakilishwa, na jenomu zilizowekwa katika vikundi tofauti vya koni zenye sifa tofauti za kijenetiki za idadi ya watu pia hutumiwa, na hivyo kupata maarifa ya kina na mapana ya Idadi ya watu. Tofauti ya thamani ya wastani ya r/m inayopatikana na seti yetu ya data inalingana na dhana kwamba kiwango cha upatanisho hutofautiana sana kati ya safu zilizogawiwa kwa spishi zile zile za taxonomic, kwa hivyo matokeo haya yanaonyesha kuwa mchanganyiko wa M. bovis clone unaweza kuonyesha tofauti za ujumuishaji upya Athari pia ni kama inavyopendekezwa na Didelot & Maiden72. Hata hivyo, kupanua kwa kiasi kikubwa data hii iliyowekwa kwa kujumuisha idadi kubwa ya jenomu za M. bovis kutaruhusu ufafanuzi zaidi wa jambo hili. Vigezo vyote vya r/m na rho/theta vinaonyesha kutofautiana kati ya matawi, na matokeo haya yanawiana na ripoti kuhusu aina nyingine za bakteria72,73.
Hatimaye, ili kuthibitisha matukio ya kupanga upya yaliyotambuliwa na bomba la Gubbins, algoriti sita tofauti zilitumiwa katika programu ya RDP4 ili kujaribu ulinganifu wa msingi tofauti tofauti. Ulimwenguni, chini ya nusu ya matukio yaliyotambuliwa na Gubbins yalithibitishwa na RDP4 (Jedwali la 4 na 5). Kwa kuzingatia seti nzima ya data, matukio matatu ya ujumuishaji upya yalithibitishwa, mawili yakihusisha nodi za ndani na nyingine ikihusisha jenomu moja katika tawi la mwisho, ambalo kolonali hazingeweza kupewa (Jedwali 4 na 5). Utambulisho wa matukio katika matawi ya mwisho unaweza kuonyesha kuwa ujumuishaji upya bado unaendelea katika aina za kisasa za M. bovis au matokeo yake hayajawekwa mahali pake70. Katika eneo hili la ujumuishaji wa kidhahania, takriban 20% ya nafasi zina nukleotidi zisizofafanuliwa (N), na hivyo kuathiri ishara ya ujumuishaji (Mchoro wa ziada 2). Zaidi ya hayo, eneo hili huathiri jeni la rrs, kusimba 16S ribosomal RNA ambayo inatarajiwa kuhifadhiwa kwa kiwango kikubwa, kwa hivyo mawimbi haya ya ujumuishaji upya yanaweza kuwa tokeo la hitilafu za mpangilio au upangaji vibaya. Kisha alignment nzima ya genome kati ya Mb0003 na Mycobacterium bovis AF2122/97 ilifanyika, na kuwepo kwa nucleotides isiyojulikana na SNPs ilithibitishwa, hivyo matatizo yanayowezekana kuhusiana na usawa usio sahihi hayakuwa kutokana na taarifa ya kibiolojia iliyotekelezwa katika kazi hii Ilionekana baada ya kujifunza programu.
Hakuna mapungufu au nucleotides zisizojulikana zilipatikana katika mikoa ya recombination ya nodes za ndani (Takwimu 4 na 5). Kuhusu matukio haya, moja ina jenomu ya Eu2 pekee na huathiri jeni ya pks12, ambayo husimba synthase ya polyketide inayowezekana; ilhali nyingine imesajiliwa katika jenomu ya Eu1 na huathiri jeni ya narX ambayo husimba upunguzaji wa nitrate unaowezekana (Jedwali la 4). Kwa ujumla, uchanganuzi wa ujumuishaji upya unaonyesha kuwa kuna idadi ndogo ya vipande vya ujumuishaji upya vilivyo na usaidizi wa takwimu, na viashirio vilivyokisiwa vinaonyesha kuwa ujumuishaji upya una athari ndogo kwa ukoo wa M. bovis. Ishara ya kuunganisha upya inatarajiwa kuwa ya chini, lakini ni muhimu kutofautisha ishara ya kweli ya mageuzi kutoka kwa kelele ya chinichini, ambayo ni kazi yenye changamoto. Ili kupunguza mawimbi ya kelele yaliyoletwa na mkusanyiko unaotegemea marejeleo na matatizo yasiyolingana 70, 71, mengine yote isipokuwa jenomu kamili yalikusanywa kuanzia mwanzo, na ubora wa kuunganisha uliangaliwa na kuthibitishwa kwa uchanganuzi wa bomba la QUAST (Jedwali la Ziada 1) . Aidha, mfululizo wa uchambuzi wa ziada ulifanyika ili kutoa uthabiti na usahihi wa uchunguzi wa jumla. Kwa hivyo, ubora wa mpangilio wa jeni za narX na pks12 ulitathminiwa kwa kusoma ramani dhidi ya Mycobacterium bovis AF2122/97. Nafasi iliyopendekezwa ya SNP katika eneo la ujumuishaji upya ilithibitishwa kwa kutumia vigezo vilivyotajwa katika sehemu ya mbinu (angalau usomaji 20 na marudio ya mabadiliko 0.9). Upolimishaji wa jeni la narX ulithibitishwa kikamilifu katika jenomu mbili (Mb1792361 na Mb7240415; 2.3%) na jenomu za pks12 jenomu: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb, Mb1704 na Mb1704 Hata hivyo, kwa genome Mb2043, nafasi sita kati ya nane hazifikii kigezo cha kina cha kusoma kwa sababu SNP inasaidiwa na kiwango cha juu cha kusoma 17, ambayo ni chini ya thamani iliyoanzishwa ya cutoff ya 20. Kwa hiyo, ujumuishaji wa genome sita (8.6%) kwenye tovuti hii ya genome inaweza kuthibitishwa (Takwimu 4 na 5).
Mwonekano wa kina wa upatanishi wa eneo la upatanishi wa hifadhidata ya Mycobacterium bovis huathiri jeni la narX ambalo husimba upunguzaji wa nitrate unaowezekana. Hakuna mapungufu au nyukleotidi ambazo hazijafafanuliwa zilipatikana katika eneo la ujumuishaji wa nodi za ndani. Tukio hili mahususi limesajiliwa katika jenomu ya Eu1. Ubora wa mpangilio wa jeni la narX ulitathminiwa kwa kupanga usomaji wa Mycobacterium bovis AF2122/97. Thibitisha eneo linalopendekezwa la SNP katika eneo la muunganisho upya kwa kutumia vigezo vilivyotajwa katika sehemu ya mbinu (angalau masomo 20 na mabadiliko ya marudio 0.9). Upolimishaji wa jeni la narX ulithibitishwa kikamilifu katika jenomu za Mb1792361 na Mb7240415 (2.3%).
Taswira ya kina ya upatanishi wa eneo la mseto wa seti ya data ya Mycoplasma bovis inayoathiri jeni pks12. Hakuna mapungufu au nyukleotidi ambazo hazijafafanuliwa zilipatikana katika eneo la ujumuishaji wa nodi za ndani. Kuhusu tukio linaloathiri usimbaji wa jeni wa pks12 unaowezekana wa synthase, lina jenomu ya Eu2 pekee. Ubora wa mpangilio wa pks12 ulitathminiwa kwa kusoma ramani ya Mycobacterium bovis AF2122/97. Thibitisha eneo linalopendekezwa la SNP katika eneo la muunganisho upya kwa kutumia vigezo vilivyotajwa katika sehemu ya mbinu (angalau masomo 20 na mabadiliko ya marudio 0.9). Upolimishaji wa jenomu Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, na Mb1960 umethibitishwa kikamilifu.
Jeni za PE na PPE zina maeneo yanayojirudiarudia ambayo husomwa vibaya kwa urahisi na mpangilio wa Illumina na upotoshaji, kwa hivyo kwa kawaida hufutwa kutoka kwa mtiririko wa habari wa kibayolojia wa washiriki wa kifua kikuu cha M. tu wakati wa kutumia mkakati wa kupanga ramani hadi-mfuatano. Makisio ya matukio ya ujumuishaji upya yaliyotumika katika kazi hii yanatokana na mkusanyiko wa de novo bila kuchuja PE/PPE. Tunaamini kwamba kwa kutekeleza mbinu na kanuni tatu tofauti za ziada kupitia SplitsTree, Gubbins pipeline na programu ya RDP4, mikakati inayotumika ni thabiti katika kuchakata na kuchuja maeneo yaliyopangwa upya yanayosababishwa na ishara za hitilafu. Hata hivyo, ili kuwatenga kuingiliwa kwa jeni la PE / PPE kwenye programu ya Gubbins na RDP4 ili kutambua makundi ya SNP, na kwa hiyo utambulisho wa mikoa ya recombination iliyopendekezwa kuathiri jeni za narX na pks12, ujirani wa jeni hizi ulichunguzwa (Mchoro wa Nyongeza 3-5). Katika M. bovis AF2122/97, jeni la narX linatenganishwa na narK2 na Mb1764c, wakati pks12 imezungukwa na Mb2075c e Mb2073c (Mchoro wa Nyongeza 3-5). Ramani inayotengenezwa kwa kutumia ramani ya synline ya MAUVE ya jenomu kamili hutoa taarifa kuhusu uhifadhi wa mfuatano wa jeni na upangaji upya, ikionyesha vizuizi vinne vya collinear, na hakuna dalili za uhamishaji wa jenomu au ubadilishaji. Kwa kuongeza, uchanganuzi wa ukamilishaji na mfuatano wa asidi ya amino ulithibitisha homolojia katika jenomu zote kamili, na hakuna PE/PPE iliyopatikana katika maeneo ya karibu ya narX au pks12. Kwa narX, jenomu moja (Mb0030) ina alama ya chini ya kisawe kwa sababu jeni ya narX ilitambuliwa kama vipande viwili (vipande 1891 na 1890). Kwa pks12, kutokana na kufanana, Mb0030 na Mb003 zilionyesha alama za chini za usawazishaji, wakati pks12 ilitambuliwa katika vipande viwili na vitatu, kwa mtiririko huo, vinavyowakilisha maeneo tofauti ya protini (Mchoro wa Nyongeza 3-5). Kwa kuzingatia maelezo haya, na programu za Gubbins na RDP4 zote hufanya uchanganuzi, angalia upatanishi wa msingi zaidi wa upeo wa 500 bp kwenye dirisha, tulithibitisha kuwa jeni la PE/PPE halitaingiliana na mawimbi ya ujumuishaji ambayo huathiri narX na pks12.
Ingawa ishara za ujumuishaji upya zilizogunduliwa katika seti hii ya data zinaweza kuchukuliwa kuwa mabaki, ni kweli kwamba ujumuishaji upya katika M. bovis hauwezi kutengwa, kwa hivyo inapaswa kuendelea kuwa somo la uchanganuzi zaidi, ambapo jenomu nzima kutoka kwa hali tofauti za epidemiolojia hupangwa kwa Muhimu.
Kulinganisha miti ya filojenetiki ya ML iliyopatikana kabla na baada ya urekebishaji wa ujumuishaji upya (Mchoro 2A, B) haukusababisha mabadiliko makubwa katika uhusiano wa filojenetiki uliokisiwa, na aina za M. bovis ziliunganishwa katika kundi moja.
Baada ya kuchora ramani 42 zilizofuatana mpya za M. bovis zinazosomwa na jenomu ya marejeleo ya M. bovis AF2122/97, upangaji wa SNP ulio na nafasi 1816 za polimafik ulipatikana. SNP nyingi (87.1%) ziko katika eneo la usimbaji, na jeni zilizoathiriwa zina sifa kulingana na kategoria za utendaji zilizoonyeshwa kwenye Bovilist (Mchoro 6A, B). Kwa kuzingatia jumla ya idadi ya jeni katika kila kategoria ya utendaji, jeni katika kategoria ya "lipid kimetaboliki" ilionyesha SNP zaidi, ikifuatiwa na "taratibu za ukuta wa seli na seli" na "metaboli ya kati na kupumua", ikionyesha kuwa ziko katika mageuzi ya M. bovis.
Uchanganuzi wa daraja la seti ya data ya M. bovis kutoka Ureno (n = 42). Jumla ya idadi ya SNP zilizosajiliwa na jeni zilizoathiriwa kwa kila aina ya utendaji (A). Jumla ya idadi ya mabadiliko ya visawe na yasiyo ya sinonimia yaliyosajiliwa na kategoria ya chaguo la kukokotoa (B).
Kwa kiwango cha kimataifa, wastani wa uwiano wa dN/dS ni bora kuliko 1.5, ambayo inaonyesha kwamba shinikizo la mageuzi la kimataifa ni kuondokana na hali ya mababu na inawakilisha hali nzuri (iliyogawanywa au kuelekezwa) na/au iliyolegeza ya uchaguzi wa utakaso. Katika kategoria za "virulence, detoxification, adaptation", "mlolongo wa kuingiza na phages", na "protini za udhibiti", zaidi ya theluthi mbili ya SNPs hazifanani (Mchoro 6B).
Katika kategoria zote, kuna jeni zilizo na SNP nyingi, na kusababisha kiwango cha wastani cha mabadiliko (yaani, wastani wa SNP kwa kila jeni) kubwa kuliko 1 (Mchoro 6A). Pks12 (Mb2074c) yenye SNP 15 na fas (Mb2553c) yenye SNP 8 zina maadili ya juu zaidi ya mabadiliko. Jeni hizi zote mbili zinahusika katika kimetaboliki ya asidi ya mafuta. Jeni ya pks husimba polyketide synthase (PKS), ambayo ni kimeng'enya chenye kazi nyingi kinachohusika katika biosynthesis ya lipid ya ukuta wa seli ya mycobacteria74,75. Jeni hii husimba polipeptidi yenye kazi nyingi ambayo inahusika katika usanisi wa mycoketides74,76. Jeni la fasi linahusika katika usanisi wa asidi ya mycolic. Jeni hizi zote mbili zina jukumu muhimu katika usanisi wa ukuta wa seli katika kuwasiliana na mwenyeji.
Ili kujifunza zaidi mabadiliko ya Mycobacterium bovis, seti mbili za jeni maalum zilichambuliwa. Kazi zilizochapishwa hapo awali kwa kutumia utungaji wa mfuatano na mbinu za filojenetiki zilibainisha jeni ambazo zilipatikana na mababu wa MTBC kupitia HGT kabla ya mseto37,38. Jeni hizi zimeorodheshwa katika Jedwali la Ziada 2. Usambazaji wa SNP wa jumla ya jeni 77 ambazo zinaweza kuhusiana na HGT zilichanganuliwa, na maeneo 26 ya polimofi yalitambuliwa, ambayo katika hali nyingi (78%) yalisababisha mabadiliko yasiyo ya jina moja (NS) (Jedwali la Nyongeza 2). Kazi ya awali kuhusu jenomu ya MTBC ilionyesha kuwa eneo la HGT la hali ya juu linaonyesha uwiano wa juu wa NS SNP ikilinganishwa na jenomu nyingine. Ikiwa mtu anadhani kuwa mikoa hii ya kuunganisha upya ilipatikana na mababu wa MTBC, na kwa hiyo, wanawakilisha polymorphisms ya kale, basi uwiano wa mabadiliko sawa unatarajiwa kuwa wa juu, kwa sababu mbadala za NS zinatarajiwa kuondolewa kwa uteuzi mbaya kwa sababu ya mabadiliko ya amino asidi Inaweza kubadilisha kazi ya protini. Kwa hivyo, matokeo yetu yanaonyesha kuwa matokeo ya utendakazi yanaweza kutokana na uingizwaji wa jeni zinazofanana na HGT, ambazo huakisi umuhimu wao kwa aina mbalimbali za kijeni zinazobadilika.
Sambamba na uchanganuzi huu, jeni zinazosimba vipengele vya mfumo wa 3R (urekebishaji, urudufishaji, na ujumuishaji wa DNA) zilichunguzwa kwa kina kulingana na orodha iliyochapishwa hapo awali na dos Vultos na washirika (2008)39. Ubadilishanaji wa vipande vinavyofanana vya DNA hauwezi kuzingatiwa moja kwa moja, ingawa inaweza kuwa mchakato wa mara kwa mara wakati bakteria zinazohusiana kwa karibu zinahusika, kama vile katika seti hii ya data; kwa kuongeza, mchakato huu unaweza kuwa ufunguo wa mbinu za kutengeneza DNA72, kwa hivyo Jukumu katika ujumuishaji wa homologous. Jumla ya nafasi 26 za polymorphic zilizosambazwa na jeni 54 zilitambuliwa (Jedwali la Nyongeza 3). Katika seti hii ya jeni, mabadiliko ya NS yalichangia karibu 65% ya matokeo, ambayo ni sawa na ripoti za awali za aina ya kifua kikuu cha Mycobacterium.
Muda wa kutuma: Oct-21-2021