Շնորհակալություն Nature այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակը սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ի համար: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել դիտարկիչի ավելի նոր տարբերակ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կցուցադրենք կայքեր առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Գենոմի հաջորդականացումը վերակենդանացրել է վարակիչ հիվանդությունների հետազոտության ոլորտը՝ բացահայտելով հիվանդության համաճարակաբանությունը, ախտածագումը, տեր-պաթոգեն փոխազդեցությունները և պաթոգենների վրա պարտադրված էվոլյուցիոն գործընթացը: Mycobacterium tuberculosis համալիրը (MTBC) Mycobacterium bovis-ը համարում է իր կենդանիների հարմարվողական անդամներից մեկը, որոնք առաջացնում են տուբերկուլյոզ (TB) ցամաքային կաթնասունների մոտ, և հանդիսանում է մանրէային էվոլյուցիայի բնորոշ մոդել: Ինչպես MTBC-ի մյուս անդամները, Mycobacterium bovis-ը ենթադրվում է, որ խիստ կլոնավորված, դանդաղ զարգացող պաթոգեն է, և ակնհայտորեն չկա ռեկոմբինացիայի կամ հորիզոնական գեների փոխանցման որևէ նշան: Այս աշխատանքում մենք համեմատական գենոմիկա ենք կիրառում ամբողջ գենոմիկայի վրա, որը բաղկացած է տարբեր տոհմածառերից (Եվրոպա և Աֆրիկա) 70 խոշոր եղջերավոր անասուններից՝ խոշոր եղջերավոր անասունների գենետիկական բազմազանության վերաբերյալ պատկերացում կազմելու համար: Վերակազմակերպման նշանները գնահատելու համար օգտագործվում են երեք տարբեր մեթոդներ: Համաշխարհային մասշտաբով, ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների փոքր քանակ է հայտնաբերվել և հաստատվել երկու անկախ մեթոդներով՝ ամուր հիմքերով: Այնուամենայնիվ, մուտացիաների համեմատ, ռեկոմբինացիան ավելի թույլ ազդեցություն ունի M. bovis-ի բազմազանության վրա (ընդհանուր r/m = 0.037): Մեր տվյալների հավաքածուում Mycobacterium bovis-ի կլոնային համալիրում ստացված r/m միջին տարբերության տարբերությունը համապատասխանում է ընդհանուր այն գաղափարին, որ ռեկոմբինացիայի աստիճանը կարող է մեծապես տարբերվել նույն տաքսոնոմիկ տեսակին վերագրվող տոհմերի միջև: Այս աշխատանքի հիման վրա Mycobacterium bovis-ի ռեկոմբինացիան չի կարող բացառվել, ուստի այն պետք է լինի հետագա ջանքերի առարկա ապագա համեմատական գենոմիկայի հետազոտություններում, որոնցում աշխարհի տարբեր համաճարակաբանական սցենարներից ստացված մեծ տվյալների հավաքածուների WGS-ը կարևորագույն նշանակություն ունի: Այնուհետև լրացուցիչ վերլուծություն է կատարվել բազմատեր տուբերկուլոզի տարածվածությունից վերցված Mycobacterium bovis-ի ավելի փոքր տվյալների հավաքածուի (n = 42) վրա, և նույնականացվել են ավելի քան 1800 լոկուսներ, որոնցից առնվազն մեկ շտամը ցուցաբերել է մեկ նուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմ (SNP): Մեծ մասը (87.1%) գտնվում է կոդավորող շրջանում, և հոմանիշ փոփոխությունների ոչ հոմանիշ փոփոխությունների գլոբալ հարաբերակցությունը (dN/dS) գերազանցում է 1.5-ը, ինչը ցույց է տալիս, որ դրական ընտրությունը կարևոր էվոլյուցիոն ուժ է, որը կիրառվում է M. bovis-ի վրա: SNP-ների ավելի մեծ համամասնություն հայտնաբերվել է «լիպիդային նյութափոխանակություն», «բջջային պատի և բջջային գործընթացներ» և «միջանկյալ նյութափոխանակություն և շնչառություն» ֆունկցիոնալ կատեգորիաներով հարուստ գեներում, ինչը բացահայտում է դրանց ներուժը Mycobacterium bovis-ի կարևորության կենսաբանության և էվոլյուցիայի մեջ: MTBC նախնիների գեների ավելի մանրամասն ուսումնասիրությունը, որոնք հակված են հորիզոնական գեների փոխանցմանը և ներառված են 3R (ԴՆԹ-ի վերականգնում, վերարտադրություն և ռեկոմբինացիա) համակարգում, բացահայտում է Taijima-ի D չեզոք թեստի գլոբալ միջին բացասական արժեքը, որը ցույց է տալիս անցյալի ընտրողական սկանավորումը: Պոպուլյացիայի ընդլայնումից հետո վերջերս առաջացած խոչընդոտը դեռևս հիմնական էվոլյուցիոն շարժիչ գործոնն է պարտադիր Mycobacterium bovis պաթոգենը տիրոջ դեմ պայքարելու համար:
Mycobacterium tuberculosis համալիրը (MTBC) բակտերիալ հարուցիչների ամենահաջողակ տաքսոններից մեկն է և բակտերիալ էվոլյուցիայի տիպիկ դեպք։ Դրա անդամները գենոմային մակարդակում ցուցաբերում են զարմանալիորեն բարձր նուկլեոտիդային նույնականություն (> 99%)1,2։ MTBC-ի տարբեր էկոտիպերը կարող են առաջացնել տուբերկուլյոզ (TB), որը վարակիչ գրանուլեմատոզ հիվանդություն է, տարբեր տեր տեսակների մոտ՝ միկրոկաթնասուններից մինչև մարդիկ3,4,5։ Ներկայումս համալիրը ներառում է մարդկանց [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] և կենդանիներին հարմարված հարուցիչներ (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" և "dassie")5,6։ M. canettii (հայտնի է նաև որպես «Nodobacter glabrata»): Վերոնշյալ միկոբակտերիաների հետ միջին նուկլեոտիդային նույնականությունը կազմում է 98%, և համեմատական գենոմիկայի աշխատանքները ցույց են տվել, որ M. canettii-ն և MTBC-ի մնացած մասը վերջերս առանձնացել են ընդհանուր նախնուց։7 Հաշվի առնելով այս հայեցակարգը՝ որոշ հեղինակներ M. canettii-ն անվանում են MTBC-ի անդամ 8:
MTBC-ն համակարգված կերպով նկարագրվում է որպես խիստ կլոնային համալիր, և դրա պոպուլյացիայի կառուցվածքը հստակորեն կարգավորվում է նվազեցված բազմազանությամբ, խոչընդոտներով, ընտրողական սկանավորմամբ և գենետիկական դրիֆտով9,10: Ենթադրելով, որ բարդ խիստ կլոնային էվոլյուցիան, ինչպիսին է պոլիմորֆիզմների բացակայությունը, չի կարող վերականգնվել ռեկոմբինացիայի միջոցով: Այս նախադրյալի հիման վրա, դիֆերենցիալ շրջանի (RD) և TbD1-ի (Mtb-ի հատուկ ջնջման 1 շրջան) գենոմային ջնջման հաջորդական իրադարձությունները առաջարկվել են որպես MTBC-ի էվոլյուցիայի մոլեկուլային մարկերներ2,5,11: Համեմատական գենոմիկայի և ամբողջ գենոմի հաջորդականության (WGS) աշխատանքը աջակցում է մարդուն հարմարված անդամների բաժանմանը ինը տոհմերի (Mycobacterium tuberculosis L1-ից L4, L7 և L8; և Mycobacterium africanum L5, L6 և L9), L2-ից L4 տոհմերը ունեն TbD1 ընդհանուր ջնջում2,11,12,13: Բացի այդ, ենթադրվում է, որ կենդանիներին հարմարված անդամները կիսում են ընդհանուր նախնին, որը սահմանվում է RD7, RD8, RD9 և RD102, 5 և 14 կլադ-սպեցիֆիկ ջնջումներով։
Հորիզոնական գեների փոխանցումը (HGT) և ռեկոմբինացիայի իրադարձությունները համարվում են հազվադեպ և տեղի են ունենում MTBC-ի նախնիների մոտ, այլ ոչ թե ամբողջ MTBC անդամի տարբեր պատմության դեպքում15,16,17: Հյուզի և նրա գործընկերների (2002) և Գուտակերի և նրա գործընկերների (2006) երկու վաղ զեկույցներում ենթադրվում է, որ ռեկոմբինացիայի իրադարձությունները կարող են նպաստել պոլիմորֆիզմների ձևավորմանը, որոնք նշում են M. tuberculosis շտամների որոշակի լոկուսներ18,19: MTBC-ում ռեկոմբինացիայի ակնհայտ բացակայության պատճառներն են՝ (1) HGT-ի մեխանիկական գործընթացը և ունակության կորուստը. (2) HGT իրադարձությունների հազվադեպությունը. (3) MTBC խորշում ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների հավանականություն չկա14,17: Վերջերս MTBC շտամի 20-ի և Mycobacterium bovis 21-ի վրա կիրառված որոշ ամբողջական գենոմի հաջորդականության (WGS) ուսումնասիրություններ տրամադրել են ռեկոմբինացիայի ապացույցներ, որոնք առաջինն են ցույց տալիս, որ MTBC շտամները հաճախ փոխանակում են ԴՆԹ-ի փոքր բեկորներ, բայց նուկլեոտիդային հաջորդականության սահմանափակ տատանումների պատճառով այս իրադարձությունները դեռևս չեն նկատվում:
Mycobacterium bovis-ը անասուններից (հիմնականում խոշոր եղջերավոր անասուններից) ամենատարածված MTBC անդամն է, չնայած այն կարող է նաև մեկուսացվել ազատորեն պահվող և ցանկապատված վայրի կենդանիներից4,22,23,24: M. bovis-ը զարգացել է հինգ հիմնական կլոնային համալիրների [Եվրոպական 1 (Eu1), Եվրոպական 2 (Eu2), Եվրոպական 3 (Eu3), Աֆրիկյան 1 (Af1) և Աֆրիկա 2 (Af2)]՝ ըստ սպոլիգոտիպավորման պրոֆիլի, հատուկ ջնջումների և որոշակի գեներում միանուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմների (SNP)25, 26, 27, 28, 29: Այս կլոնային համալիրները ցույց են տալիս Mycobacterium bovis պոպուլյացիայի բազմազան կառուցվածքը և դրա կապը աշխարհագրական շրջանների հետ: Բացի այդ, Զիմպելի և նրա համագործակիցների կողմից վերջերս կատարված WGS աշխատանքը (2020) մշակել է Mycobacterium bovis-ի SNP-ի վրա հիմնված ֆիլոգենեզ՝ ավելի քան 1900 գենոմով, ինչը ցույց է տալիս, որ կան առնվազն չորս տարբեր տոհմածառեր (անվանվել են Lb1-ից Lb1-ից Lb4), որոնք լիովին չեն համապատասխանում նախկինում սահմանված կլոնային համալիրին, չնայած կարող է հաստատվել նաև աշխարհագրական առանձնահատկությունը30: Այս հեղինակները կատարել են ֆիլոգենեզի և մոլեկուլային թվագրման դիֆերենցիալ վերլուծություն, բայց չեն ուսումնասիրել ռեկոմբինացիան30:
Նախկինում տարբեր մոլեկուլային տեխնիկաների, ինչպիսիք են սպոլիգոտիպավորումը, MIRU-VNTR-ը (միկոբակտերիալ ինտերսպերսված կրկնվող միավոր-փոփոխական տանդեմային կրկնության համար) և վերջերս կատարված SNP տիպավորումը բացահայտել են գենետիկական բազմազանության որոշակի մակարդակ M. bovis շտամների միջև 31,32,33, 34,35: Գենետիկական տարբերակման տարբերակումը դարձել է կարևոր գործիք հիվանդությունների համաճարակաբանության ուսումնասիրության մեջ, որը օգտակար է պաթոգենեզի, վիրուլենտության և հիվանդության փոխանցման խորը ըմբռնման համար: WGS մեթոդի ի հայտ գալը հնարավորություն է տալիս բացահայտելու Mycobacterium bovis գենոմի կողմից պարտադրված էվոլյուցիոն շարժիչ գործոնները՝ տարբեր տերերի և համաճարակաբանական սցենարների նկատմամբ հարմարվողականության և կայունության գործընթացում:
Այս աշխատանքում մենք օգտագործում ենք համեմատական գենոմիկ վերլուծություն Mycoplasma bovis-ի տարբեր տվյալների հավաքածուների (n = 70), այդ թվում՝ տարբեր կլոնային համալիրներից ստացված մեկուսացված նմուշների վրա, որպեսզի պատկերացում կազմենք Mycoplasma bovis-ի էվոլյուցիոն գործընթացի, մասնավորապես՝ ֆիլոգենետիկ կապերի և ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների վերաբերյալ: Որպես այս վերլուծության լրացում, Պորտուգալիայի լավ բնութագրված բազմատեր տուբերկուլյոզի տարածքից ստացված M. bovis մեկուսացված նմուշների ենթատվյալների հավաքածուն (n = 42)31,36 հետագայում ուսումնասիրվել է՝ եզրակացնելու համար, որ ոչ նույնականությունը զգացվում է իմաստային (dN) և հոմանիշ (dS) նուկլեոտիդային փոխարինումների հարաբերական հարաբերակցության, ինչպես նաև գրականության մեջ նշված որոշակի գենոմների էվոլյուցիոն ներդրման միջև: Դրանք 37,38 ստացվել են MTBC նախնիների կողմից HGT-ի միջոցով և կոդավորում են 3R (ԴՆԹ-ի վերականգնում, վերարտադրություն և ռեկոմբինացիա) համակարգի գեների բաղադրիչները 39: Ընտրեք HGT-ի միջոցով ստացված գեները, քանի որ դրանք կարող են ներկայացնել հին պոլիմորֆիզմներ, ուստի ենթադրվում է, որ դրանք կարող են պարունակել հոմանիշ փոփոխությունների ավելի բարձր համամասնություն: 3R համակարգում ներառված գեները ընտրվել են, քանի որ M. tuberculosis շտամների վրա նախորդ աշխատանքները ցույց են տվել ընդհանուր բացասական/մաքրման ընտրություններ, որոնք ազդում են այդ գեների վրա, և դրանք կարող են կարևոր դեր խաղալ էվոլյուցիայի մեջ 39: Այս աշխատանքի մեկ այլ նպատակ է եզրակացնել վերակազմակերպման իրադարձությունների գոյությունը: Այս պատճառով, հաշվի առնելով, որ Պորտուգալիայից ստացված մեր տվյալների բազան պարունակում է միայն եվրոպական կլոնային համալիր 2-ի գենոմները և այն շտամները, որոնց չի վերագրվել կլոնային համալիրը, մենք որոշեցինք ներառել հրապարակայնորեն հասանելի գենոմի տվյալներ՝ վերջապես բոլոր կլոնային համալիրների ներկայացուցիչ ստանալու և արդյունքների կայունությունն ու լայնությունը բարելավելու համար:
Այս աշխատանքի կենտրոնում են Պորտուգալիայի էնդեմիկ բազմատեր տուբերկուլոզի տեսարանից 42 նոր հաջորդականացված Mycoplasma bovis գենոմներ (մանրամասները՝ ստորև), որոնք նախկինում բնութագրվել են համաճարակաբանական տեսանկյունից36: Հաշվի առնելով, որ Պորտուգալիայից ստացված տվյալների հավաքածուն ներառում է միայն եվրոպական 2 կլոնային համալիրների և շտամների ներկայացուցիչներ՝ առանց նշանակված համալիրների, ավելացվել են հանրությանը հասանելի ամբողջական գենոմի հաջորդականության տվյալներ՝ M. bovis կլոնային համալիրների բոլոր ներկայացուցիչներին ներառող տվյալների հավաքածուն ընդլայնելու համար: Հետևաբար, այս աշխատանքում օգտագործվել են ամբողջական գենոմի հաջորդականության երեք տվյալների աղբյուրներ՝ գենոմի ամբողջական/նախագծային հավաքածու, մինչև 10 կառուցվածք, որոնք պահվում են NCBI-ում (Կենսատեխնոլոգիական տեղեկատվության ազգային կենտրոն) (n = 15 իզոլյատ), պահվում են SRA-ում (հաջորդականության ընթերցման արխիվի Illumina fastq ֆայլը) և ներկայացնում են M. bovis կլոնների բարդ բազմազանությունը (n = 12 իզոլյատ)30, և Պորտուգալիայից ստացված 42 նոր հաջորդականացված գենոմներ: Mycobacterium bovis BCG-ն (Bacille Calmette-Guerin) բացառվել է NCBI որոնումից: M. bovis AF2122/97-ը սովորաբար օգտագործվում է որպես տվյալների բազայում ներառվող հղման գենոմ: Քանի որ African 1 կլոնավորման համալիրով ներկայացված ամբողջ գենոմի հաջորդականությունը հանրությանը հասանելի չէ, և Af2-ի ու Eu1-ի ներկայացուցչական շտամների գենոմների փոքր քանակի պատճառով, այս դեպքերում օգտագործվել են SRA-ի կողմից տրամադրված սկզբնական հաջորդականության տվյալները: Զիմպելի և նրա համագործակիցների աշխատանքը (2020) օգնել է նույնականացնել վերոնշյալ կլոնավորման համալիրի գենոմը և օգնել է ընտրել Mycobacterium bovis-ը տվյալների բազայում ներառելու համար: Eu3-ի համար նկարագրվում է միայն մեկ տեսակի գենոմ (Branger et al., 2020), ուստի մեր կողմից ներառված գենոմը Eu3 համալիրի առանձին ներկայացուցիչ է:
Համաշխարհային մասշտաբով, այս տվյալների հավաքածուն ներառում է 70 խոշոր եղջերավոր անասուն M. bovis, որոնք մեկուսացվել են 8 տեր տեսակներից և տարածված են 12 երկրներում 1985-ից 2016 թվականներին: 36 տեսակ նշանակված է որպես Eu2, 7 տեսակ՝ Eu1, 1 տեսակ՝ Eu3, 3 տեսակ՝ Af1, 4 տեսակ՝ Af2, իսկ 19-ը չեն վերագրվում որևէ կլոնային համալիրի (մանրամասները՝ ստորև): Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված Mycobacterium bovis-ի մանրամասն տեղեկատվությունը (ներառյալ մուտքագրման համարը) ներկայացված է աղյուսակ 1-ում և լրացուցիչ աղյուսակ 1-ում:
Այս ուսումնասիրության կենտրոնում են Պորտուգալիայի կենդանիների տուբերկուլյոզի օջախներից Mycobacterium bovis-ի 42 նոր հաջորդականացված ամբողջական գենոմներ, որոնք տարածվել են ավելի քան 12 տարի, քանի որ վայրի կենդանիների և կենդանիների հիվանդությունների պոտենցիալ համակարգերը պարբերաբար մոնիթորինգի են ենթարկվել 31,36 (Լրացուցիչ նկ. 1): Հետագա ընթացակարգերի համաձայն, այս շտամները 2003-ից 2015 թվականներին մեկուսացվել են խոշոր եղջերավոր անասուններից (n = 14), կարմիր եղջերուներից (n = 16) և վայրի խոզերից (n = 12). կենդանիներին հավաքել և մշակել առաջարկվող արձանագրության ուղեցույցներին համապատասխան: Հյուսվածքային նմուշները գտնվում են OIE ցամաքային կենդանիների ձեռնարկում և պատվաստվում են Stonebrink և Löwenstein-Jensen պիրուվատային պինդ և հեղուկ միջավայրերում: Կուլտուրաները ինկուբացվում են 37°C ջերմաստիճանում, և աճը ստուգվում է շաբաթը մեկ անգամ առնվազն 12 շաբաթվա ընթացքում: Գաղութները պահվում են անմիջապես գլիցերինի լուծույթում -80°C ջերմաստիճանում: Mycobacterium ընտրողական միջավայրում (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) արխիվացված սկզբնական նմուշները in vitro մեկ անցման միջով են անցել՝ WGS ծրագրի ԴՆԹ-ն ստանալու համար: Դրա համար սառեցված կուլտուրայի հիմնական լուծույթը հարստացվել է 5% նատրիումի պիրուվատով և 10% ADS-ով (50 գ ալբումին, 20 գ գլյուկոզ, 8.5 գ նատրիումի քլորիդ 1 լիտր ջրում) Middlebrook 7H9 սարքի վրա 37°C Retrain ջերմաստիճանում: 4 շաբաթ աճից հետո միջավայրը թարմացվել է, և մշակույթը պարբերաբար վերահսկվել է մինչև աճի դիտարկումը: Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով, գնդիկը վերասուսպենդացվել է 500 մկլ ֆոսֆատային բուֆերային աղային լուծույթում (PBS), տաքացվել է 99°C ջերմաստիճանում 30 րոպե, ցենտրիֆուգացվել է, և վերին շերտը պահվել է -20°C ջերմաստիճանում մինչև WGS-ի ստացումը: Բոլոր ընթացակարգերը կատարվում են 3-րդ մակարդակի կենսաանվտանգության հաստատություններում:
WGS զույգ ծայրերով գենոմի գրադարանը պատրաստվում է ԴՆԹ-ի յուրաքանչյուր նմուշի եզակի ինդեքսի միջոցով և հաջորդականության որոշման համար օգտագործում է Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 նմուշ) և HiSeq (2 × 150 pb) (երկու իզոլյատ) տեխնոլոգիան (Eurofins Genomics, Գերմանիա): Արտադրողի հրահանգների համաձայն՝ գենոմային ԴՆԹ-ն հաջորդականության որոշման համար օգտագործեք Illumina Genome Analyzer-ը՝ կրկնակի ծայրերով մոդուլային միացմամբ, իսկ գրադարանը կառուցելու համար օգտագործեք Illumina-ի Nextera XT DNA Library Prep Kit-ը:
Հաշվի առնելով SRA-ից ստացված տվյալները (n = 12), կլոնային համալիրի նույնականացումը կարող է օգտագործվել որպես համապատասխան հրապարակման 30, 41, 43 մետատվյալներ: Երբ դիտարկվում է ամբողջական գենոմը, բացառությամբ Mycobacterium bovis AF2122/97-ի և Mycobacterium bovis 3601-ի, որոնք համապատասխանաբար ճանաչված են որպես Eu1 և Eu3 կլոնային համալիրի 25, 29 անդամներ, այն նույնն է, ինչ Mycobacterium tuberculosis H37Rv-ի ամբողջական գենոմը (NCBI մուտքի համարը՝ NC_000962.3): Գենոմի համընկնումը կատարվում է MAFFT-ի (ամինաթթվային կամ նուկլեոտիդային հաջորդականության բազմակի համընկնման ծրագիր, տարբերակ 7.458) և -addfragments48 պարամետրի միջոցով: Այնուհետև, որոնվում են տարբեր կլոնային համալիրների բացակայությունը և/կամ SNP առանձնահատկությունների առկայությունը:
Նոր հաջորդականացված Mycobacterium bovis-ը (n = 42) և հավաքված գենոմի նախագծի սկզբնական կարդացումները (n = 3) համապատասխանեցնում են համալիրը Mycobacterium tuberculosis H37Rv հղման գենոմի հետ՝ vSNP խողովակաշարի միջոցով, և տարբեր կլոնների ջնջման և/կամ SNP առանձնահատկությունների առկայությունը։ Կատարվել է որոնում։
Հավաքեք տեղեկություններ SNP-ի և սպոլիգոտիպավորման պրոֆիլների առանձնահատկությունների բացակայությունից և/կամ առկայությունից/բացակայությունից՝ գենոմային տվյալները համապատասխան կլոնալ համալիրին վերագրելու համար: Չորս նախնական կառուցվածքների համար սպոլիգոտիպավորման պրոֆիլը հնարավոր չէ եզրակացնել, ուստի դրանք ներառված են «բարդություն չունեցող» խմբում:
Այս աշխատանքին հաջորդող կենսաինֆորմատիկայի աշխատանքային հոսքը սկսվում է de novo հավաքումից և քարտեզագրումից մինչև հղման ռազմավարություն՝ նպատակ ունենալով ուսումնասիրել ռեկոմբինացիայի իրադարձությունները և գենոմի որոշակի պոլիմորֆիզմները: Նկար 1-ը ներկայացնում է հետևյալ քայլերի հոսքագիծը: Ռեկոմբինացիայի վերլուծության համար բոլոր գենոմներն օգտագործվում են եզրակացությունների և դրանց հետ կապված ցուցանիշների հուսալիությունը բարձրացնելու համար:
Գենոմի կոնսենսուսային հաջորդականությունների ստեղծման սխալները նվազեցնելու համար մենք նախ իրականացրեցինք de novo հավաքում, ապա ստացանք միջուկի բազմակի դասավորություններ: Unicycler խողովակաշարն այժմ հասանելի է https://github.com/rrwick/Unicycler49 կայքում և օգտագործվում է 54 հաջորդականացված գենոմների de novo հավաքում կատարելու համար (42 նոր հաջորդականացված և 12 fastq ֆայլեր, որոնք վերականգնվել են SRA-ից): Ամփոփելով՝ զրոյից հավաքվելուց առաջ ընթերցման որակի վերլուծությունը կատարվել է FastQC տարբերակ 0.11.7-ում (https://github.com/s-andrews/FastQC) և Trimmomatic տարբերակ 0.36-ում (կիրառվում են «կտրել ադապտերներ և այլ լուսավորման-սպեցիֆիկ հաջորդականություններ ընթերցումներից» և «Կտրել հիմքերը ընթերցման ավարտից, եթե ցածր է 20-ի շեմային որակը» տարբերակները) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50: Այնուհետև, գենոմի հավաքման համար օգտագործվել է SPAdes optimizer49-ը, իսկ հավաքումից հետո օպտիմալացման համար՝ Pilon տարբերակ 1.1851-ը: Սխալ հավաքումից խուսափելու համար ընտրվել է պահպանողական կամրջման ռեժիմ, և k-mer չափը որոնվել և ընտրվել է ընթերցման երկարության 20%-ից 95%-ի սահմաններում: Հետևեք SPAdes ուղեցույցներին և հաշվի առեք ընթերցման չափը, ջնջեք 300 զույգ հիմքից փոքր կոնտիգները և սահմանեք 20 ընթերցման խորության ծածկույթի սահմանային սահմանը՝ 52: De novo հավաքման ռազմավարության մեջ գենոմային շրջանները, ինչպիսիք են բարձր կրկնվող պրոլին-գլյուտամատը (PE) և պրոլին-պրոլին գլուտամատը (PPE) պարալոգները, չեն հեռացվել:
De novo հավաքման որակը գնահատվում է QUAST խողովակաշարի միջոցով (http://quast.sourceforge.net/quast.html), որը նպաստում է կոնտիգի և M. bovis AF2122/97 հղման գենոմի (NCBI մուտքի համարը՝ LT708304.1) քարտեզագրման վերականգնմանը (որակի պարամետրերի համար տե՛ս լրացուցիչ աղյուսակ 1-ը):
vSNP խողովակաշարի օգնությամբ (https://github.com/USDA-VS/vSNP), Illumina-ի հաջորդականացումից ստացված նոր հաջորդականացված M. bovis-ի FASTQ ֆայլը համեմատվում է M. bovis AF2122/97 հղման գենոմի (LT708304.1)) հետ: Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 լավագույն փորձի առաջարկությունների համաձայն՝ վերակարգավորման համար կիրառվում են ստանդարտ ֆիլտրի պարամետրեր կամ տարբերակային զանգվածային միավորներ: Արդյունքները զտվում են SAMtools-ի ամենացածր զանգվածային միավորով՝ 150-ով և AC = 2-ով: Աղտոտումը բացառելու համար ցուցմունքները ստուգելու համար օգտագործվում է նաև Kraken-ը (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/): Մեր աշխատանքում հաջորդականության ռազմավարություններին համապատասխանեցնելու համար օգտագործվող vSNP խողովակաշարը ուսումնասիրում է մի շարք սահմանված SNP-ներ և թիրախներ, ինչպես նաև բացառում է խառը վարակի սցենարները: Կարդացված գենոմի ծածկույթը ավելի լավ է, քան 99% (Լրացուցիչ աղյուսակ 1):
Քարտեզագրման սխալներից և սխալ SNP-ներից խուսափելու համար զտեք տարբերակը հետևյալ դեպքերում՝ (1) այն հաստատվում է 20-ից պակաս ցուցմունքներով, (2) այն հայտնաբերվում է 0.9-ից պակաս հաճախականությամբ, (3) այն գտնվում է առնվազն մեկ շտամում, բայց առնվազն մեկ այլ շտամում կան բացթողումներ: Ինտեգրված գենոմիկայի դիտարկիչը (IGV) 2.4.19 տարբերակն է (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56: SNP-ները և դիրքերը քարտեզագրման կամ դասավորության խնդիրներով տեսողականորեն ստուգելու համար օգտագործվել է ինտեգրված գենոմիկայի դիտարկիչը (IGV) 2.4.19 տարբերակը (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56: Քանի որ պրոլին-գլյուտամատ (PE) և պրոլին-պրոլին գլուտամատ (PPE) գեները շատ կրկնօրինակված են և բազմագենային ընտանիքի մաս են կազմում, դրանք հեշտությամբ սխալ են հասկացվում Illumina-ի հաջորդականության և սխալ քարտեզագրման միջոցով, ուստի դրանք նախընտրելի են: Միկոբակտերիալ կենսաինֆորմատիկայի աշխատանքային հոսքը հեռացրեց տուբերկուլյոզի համալիրի անդամները, երբ SNP-ները հաստատելու համար քարտեզագրման հաջորդականության ռազմավարությունն օգտագործվեց: Հետևաբար, մենք վերլուծությունից զտեցինք PE/PPE գեները և ինդելները:
Ըստ Bovilist-ի (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), բոլոր SNP-ները բաժանված են ֆունկցիոնալ կատեգորիաների: SnpEff խողովակաշարը (https://pcingola.github.io/SnpEff/) օգտագործվում է SNP հետևանքները (հոմանիշային կամ ոչ հոմանիշային փոփոխություններ) եզրակացնելու համար: Ստեղծվել է Mycobacterium bovis AF2122/97 գենոմի նոր տվյալների բազա (LT708304.1):
Հիմնական գենոմի բազմակի դասավորությունը կատարվել է Parsnp v1.2-ի միջոցով, որն այժմ հասանելի է https://github.com/marbl/parsnp57 կայքում, օգտագործելով 69 ամբողջական գենոմներ/նախագծային հավաքածուներ (-c տարբերակով), և M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)-ը օգտագործվել է որպես հղում: Կատարվել են չորս հիմնական բազմակի դասավորություններ՝ միայն Eu2 կլոնավորման համալիրի անդամները (n = 37), ներառյալ եվրոպական կլոնավորման համալիրի բոլոր անդամները (n = 44), ներառյալ եվրոպական և աֆրիկյան կլոնավորման համալիրի միացման կետը (n = 51), և ներառում են այս ուսումնասիրության մեջ ներառված բոլոր Mycobacterium bovis-ները (n = 70):
Parsnp-ի կողմից ստեղծված միջուկի դասավորությունն օգտագործվում է CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58-ի միջոցով RAxML-ի միջոցով ֆիլոգենետիկ ծառը եզրակացնելու և 1000 ուղղորդվող կրկնօրինակում կատարելու համար։
Ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների առկայությունը զուգահեռաբար ստուգելու համար օգտագործվում են երեք տարբեր ալգորիթմներ և կենսաինֆորմատիկական գործիքներ՝ SplitsTree4 ծրագիրը, Gubbins (անաչառ տոհմածառ նուկլեոտիդային հաջորդականություններում ռեկոմբինացիայի միջոցով) խողովակաշարը և RDP4 (ռեկոմբինացիայի հայտնաբերման ծրագիր, բետա տարբերակ 4.101) ծրագիրը։
Ֆիլոգենետիկ ցանցը առանց արմատների հաշվարկելու համար օգտագործվում է SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-ում ներդրված բաժանման մեթոդը՝ Phi թեստի միջոցով վիճակագրական ստուգման համար, և նշանակալիության շեմը p = 0.05 է: Parsnp-ի հիմնական բազմակի դասավորության վերլուծությունն օգտագործվում է որպես մուտքային տվյալ, և իրականացվում է բաժանման բաժանումը որպես ցանցի ստանդարտ:
Գաբբինսի խողովակաշարի v2.3.1 տարբերակը (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) աշխատում է լռելյայն պարամետրերով՝ որպես Mycobacterium bovis-ի վրա ռեկոմբինացիայի ազդեցությունը գնահատելու մեկ այլ միջոց: Խողովակաշարում իրականացված ալգորիթմը վերակառուցում է համապատասխան կլոնի տոհմածառը: Մեր տվյալների հավաքածուի ամբողջական գենոմը/նախագծային հավաքածուն և հղման գենոմը (խոշոր եղջերավոր անասուն AF2122/97, LT708304.1) փոխադարձաբար փոխկապակցված են. և սկանավորում են SNP-ի դիրքը ծառի յուրաքանչյուր ճյուղի վրա՝ ռեկոմբինացիայի իրադարձությունը ներկայացնող SNP կլաստերը հայտնաբերելու համար: Ճյուղի զրոն: Ենթադրենք, որ ռեկոմբինացիայի իրադարձություն չկա, ինչը նշանակում է, որ ճյուղի վրա տեղի ունեցող SNP-ները պետք է հավասարաչափ բաշխված լինեն: Parsnp-ից ստացված միջուկի բազմակի դասավորությունը և RAxML-ից ստացված լավագույն գնահատականով ML ծառը օգտագործվում են որպես մուտքային ֆայլեր:
Վերջապես, Գաբբինսի խողովակաշարի կողմից առաջարկվող վերակազմակերպման իրադարձությունը հաստատելու համար, RDP467-ում իրականացված վեց ալգորիթմները (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 և SiScan66) կիրառվում են Parsnp-ի հիմնական բազմակի դասավորության վրա՝ լռելյայն կարգավորումներով: Մենք որոշեցինք, որ RDP4-ում իրականացված ալգորիթմներից առնվազն երեքը պետք է հետևողականորեն ցուցադրեն կարևոր ազդանշան՝ յուրաքանչյուր վերակազմակերպման իրադարձությունը ստուգելու համար:
Հաշվի առնելով, որ և՛ Gubbins-ը, և՛ RDP ծրագիրը փնտրում են ռեկոմբինացիայի ազդանշաններ՝ ստուգելով միջուկի բազմակի դասավորությունները մինչև 500 զույգ հիմքով պատուհանում, և հաստատելով, որ PE/PPE գեների ներառումը de novo հավաքման ընթացքում չի խանգարի հայտնաբերված ռեկոմբինացիայի ազդանշաններին, հետագա վերլուծությունը կատարվում է հոմոգծայնության միջոցով։ Ստուգվում է ռեկոմբինացիայի իրադարձությունը նույնականացնող գենի շրջակայքը։ Գենոմի ամբողջական տարբերակը սինգծային քարտեզը կառուցվել է MAUVE-բազմագենոմային դասավորության միջոցով (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html)՝ գենոմի տեղային տեղափոխությունները կամ ինվերսիաները բացառելու համար։ Բացի այդ, ամբողջ գենոմն օգտագործվել է ամինաթթվային հաջորդականության վրա հոմոգծայնության վերլուծություն կատարելու համար SyntTax վեբ սերվերի միջոցով (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/):
Պորտուգալական բազմատեր տուբերկուլյոզային համակարգից ստացված գենոմի տվյալների ավելի խորը վերլուծությունը նպատակ ունի ստուգել գրականության մեջ նշված գեների պոլիմորֆիզմը: Այդ գեներն են 37,38 և 3R կոդավորող գենը, որը ստացվել է MTBC նախնիների կողմից HGT (ԴՆԹ-ի վերականգնում, վերարտադրություն և ռեկոմբինացիա) համակարգի բաղադրիչների միջոցով 39: Գեների և նուկլեոտիդների բազմազանությունը (π) և Տաջիմայի D չեզոք թեստի պարամետրերի մուտքագրումը հաշվարկելու համար օգտագործեք ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) և DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) ծրագրերը:
Ստացվել է առավելագույն հավանականության (ML) ֆիլոգենետիկ ծառ, որը հիմնված է 69 Mycoplasma bovis իզոլյատների և հղման գենոմների վրա (Նկար 2Ա): Միագենային կամ բազմալոկուսային ծառերի համեմատ, այս ռազմավարությունը թույլ է տալիս ստեղծել ավելի հզոր ծառեր, որոնք չեն արտացոլում ամբողջ գենոմի փոփոխականությունը և, հետևաբար, ցուցաբերում են տեսակների միջև տարբերակման ավելի ցածր ունակություն 68,69: ML ծառի տոպոլոգիական կառուցվածքը սովորաբար համապատասխանում է կլոնների բարդ դասակարգմանը: Eu2-ի գենոմը խմբավորված է ճյուղում, իսկ Af1-ի գենոմը նույնպես խմբավորված է միասին (Նկար 2Ա): Արդյունքը նաև համապատասխանում է Mycobacterium bovis-ի հայտնի էվոլյուցիոն կապին, այսինքն՝ մեծ տարբերություն կա Eu1 անդամի և մյուս բոլոր կլոնային համալիրներից ու գենոմներից բաղկացած խմբի միջև, բայց կլոնային համալիրը 30 չի նշվում: Կլոնային համալիրի և ֆիլոգենետիկ ծառի վրա դիտարկվող կապի միջև փոքր անհամապատասխանությունը կարելի է բացատրել այն փաստով, որ կլոնային համալիրը նկարագրվում է որոշակի գենոմային շրջանների հիման վրա, մինչդեռ ֆիլոգենետիկ ծառը հիմնված է ամբողջ գենոմը ներկայացնող հիմնական գենոմների բազմակի դասավորությունների վրա։
Առավելագույն հավանականության ֆիլոգենետիկ ծառը (ԱՀԾ) կառուցվում է Mycobacterium bovis գենոմի հիմնական գենոմի դասավորվածության հիման վրա՝ ռեկոմբինացիայի տեղամասի հեռացումից (Ա) առաջ և (Բ) հետո: Ճյուղերի գույները ներկայացնում են Mycobacterium bovis կլոնային համալիրը. Եվրոպա 1-ը մանուշակագույն է, Եվրոպա 2-ը՝ կարմիր, Եվրոպա 3-ը՝ կապույտ, Աֆրիկա 1-ը՝ նարնջագույն, իսկ Աֆրիկա 2-ը՝ կանաչ: Ծառը արմատավորված է և գծված է մասշտաբով, իսկ ճյուղի երկարությունը չափվում է յուրաքանչյուր տեղամասի փոխարինման համար:
Mycobacterium tuberculosis համալիրը նկարագրվում է որպես կլոնային էվոլյուցիայի ենթարկված, և տարիների ընթացքում կուտակված ապացույցների մեծ մասը հաստատում է այն գաղափարը, որ շարունակական HGT-ն և ռեկոմբինացիոն իրադարձությունները տեղի չեն ունենա MTBC15,17,18-ի հայտնաբերելի մակարդակում։
Նախորդ աշխատանքները ցույց են տվել, որ MTBC շտամների միջև կարող է լինել սահմանափակ ռեկոմբինացիա20,21, մինչդեռ մյուսները չեն կարողացել բացահայտել չափելի ռեկոմբինացիայի դեպքեր70,71: Վերաքննարկեք այս հարցը՝ կենտրոնանալով Mycobacterium bovis-ի վրա, որը տարբերվում է նախորդ աշխատանքից, որը դիտարկել է միայն Mycobacterium tuberculosis70,71, կամ դիտարկեք MTBC-ն որպես ամբողջություն, որտեղ գրեթե չկա M. bovis-ը20, կամ դիտարկեք միայն սահմանափակ խոշոր եղջերավոր անասունների ֆրակցիաները: Այս աշխատանքում միկոբակտերիաների տվյալների բազայում կա ընդհանուր առմամբ 70 շտամ, որոնք ներկայացնում են բոլոր կլոնային համալիրները, որոնք օգտագործվում են ռեկոմբինացիայի սկրինինգի համար: Տվյալների բազան մասշտաբավորված է չորս կուտակային մակարդակների համաձայն՝ (1) Eu2 անդամներ, (2) բոլոր եվրոպական կլոնային համալիրի անդամները (այսինքն՝ Եվրոպա), (3) եվրոպական և աֆրիկյան կլոնային համալիր (Eu + Af) և (4) ամբողջ տվյալների հավաքածուները (ներառյալ գենոմները, որոնք չեն ներառված արդեն նկարագրված որևէ կլոնավորման համալիրում):
Այս վարկածը հետագա ուսումնասիրելու համար իրականացվել է բաժանված-քայքայման ցանց՝ գենոմների միջև ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների բացակայությունը գնահատելու համար, քանի որ այս մեթոդը կարող է պատկերացնել անհատների միջև նախնիների կապը և ցուցադրել հակասական ֆիլոգենետիկ ազդանշաններ: Վերլուծության մեջ ներառված բոլոր չորս տվյալների հավաքածուները հաստատել են ցանցում օղակների գոյությունը (այսինքն՝ տարածքներ, որոնք չեն միավորվում մեկ ծառի մեջ), սակայն Phi թեստը վիճակագրական աջակցություն չունի (Eu2, p = 0.0956; Եվրոպա, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; ամբողջ տվյալների հավաքածուն p = 0.2451), ինչը թույլ ապացույցներ է տրամադրում վերակազմակերպման իրադարձությունների գոյության համար (Նկար 3A-D):
Եվրոպայում՝ 2 գենոմ (n = 37) (A), եվրոպական գենոմներ (n = 44) (B), եվրոպական և աֆրիկյան գենոմներ (n = 51) (C) և ամբողջ տվյալների հավաքածուն (n = 70) (D):
Այս վերլուծությունից հետո և բոլոր ցանցերում ցիկլիկ դիտարկումները հաշվի առնելով՝ Գաբբինսի խողովակաշարում իրականացված վերակառուցման ալգորիթմը կիրառվեց կլոնային տոհմը վերակառուցելու և M. bovis գենոմի վրա ռեկոմբինացիայի ազդեցության գնահատականը լրացնելու համար։ Եզրակացություն արեք ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների կուտակային թվի մասին, որոնց մեծ մասը տեղի է ունեցել տերմինալ ճյուղերում (այսինքն՝ մեկ գենոմում) (աղյուսակ 2): Այս ցուցանիշները ցույց են տալիս ամբողջ տվյալների հավաքածուի համապատասխանությունը և ցույց են տալիս, որ ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների հաճախականությունը մուտացիաների հաճախականությունից 200-ից 300 անգամ մեծ է: Երբ ճյուղի վրա ռեկոմբինացիայի և կետային մուտացիաների հարաբերական արագությունները ներկայացնող rho/theta պարամետրը, կարծես, 0.0037-ից 0.0056 միջակայքում է (աղյուսակ 3): Վերջերս 38 M. bovis շտամի վերաբերյալ հրապարակված աշխատանքը ցույց տվեց ավելի բարձր rho/theta արժեք (rho/theta = 0.1), քան այս տվյալների հավաքածուում ստացվածը, սակայն Պատանեի և նրա գործընկերների աշխատանքը օգտագործել է հղումային հավաքում՝ ռեկոմբինացիայի պարամետրերը եզրակացնելու համար։ Հավաքման ընթացակարգով պայմանավորված ընթացակարգային մանրուք կապված է տերմինալ ճյուղում ենթադրյալ ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների առատության հետ։
Հաջորդը, r/m պարամետրը ներկայացնում է ռեկոմբինացիայի և մուտացիայի ներմուծման բազմազանության հարաբերակցությունը, և դրա միջին արժեքը տատանվում է 0.025-ից 0.037 միջակայքում, ինչը ցույց է տալիս, որ մուտացիաների համեմատ ռեկոմբինացիան ավելի ցածր ընդհանուր ազդեցություն ունի M. bovis-ի գենետիկական բազմազանության վրա (տե՛ս աղյուսակ 3): Լայնածավալ համեմատության համար նմանատիպ մեթոդ է օգտագործվել 23 գենոմից կազմված MTBC տվյալների համար r/m պարամետրը գնահատելու համար, որը ցույց է տվել 0.48620 միջին արժեք, մինչդեռ Պատանեի և գործընկերների 38 M. bovis տվյալների համար այն ցույց է տվել, որ միջին արժեքը կազմում է 0.98: Առաջին ուսումնասիրության մեջ M. bovis-ի աշխատանքում ներառված 23 գենոմներից միայն երկուսն են (M. bovis BCG-ն և հղման շտամը), ուստի ստացված արժեքը կարող է կողմնակալ լինել M. tuberculosis գենոմի գերարտահայտման պատճառով: Երկրորդ զեկույցում վերլուծված Mycobacterium bovis պոպուլյացիաները հիմնականում վերցված են Միացյալ Նահանգներից և ընտանի կենդանիներից: Ի հակադրություն սրա, մեր տվյալների հավաքածուում ներկայացված են ավելի շատ աշխարհագրական վայրեր և տեր տեսակներ, և օգտագործվում են նաև տարբեր կլոնային համալիրներում խմբավորված գենոմներ՝ տարբեր պոպուլյացիոն գենետիկական բնութագրերով, այդպիսով ստանալով ավելի խորը և լայն պոպուլյացիոն գիտելիքներ: Մեր տվյալների հավաքածուով ստացված r/m միջին արժեքի տարբերությունը համապատասխանում է այն հայեցակարգին, որ ռեկոմբինացիայի աստիճանը մեծապես տարբերվում է նույն տաքսոնոմիկ տեսակին վերագրվող տոհմերի միջև, ուստի այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ M. bovis կլոնային համալիրը կարող է ցուցադրել ռեկոմբինացիոն տարբերություններ: Ազդեցությունը նույնպես համապատասխանում է Դիդելոտի և Մեյդենի առաջարկածին72: Այնուամենայնիվ, այս տվյալների հավաքածուի զգալիորեն ընդլայնումը՝ ներառելով M. bovis գենոմների ավելի մեծ քանակ, թույլ կտա ավելի մանրամասն պարզաբանել այս կետը: Եվ՛ r/m, և՛ rho/theta պարամետրերը ցույց են տալիս փոփոխականություն ճյուղերի միջև, և այս արդյունքը համապատասխանում է այլ մանրէային տեսակների վերաբերյալ զեկույցներին72,73:
Վերջապես, Գաբբինսի խողովակաշարի կողմից հայտնաբերված վերակազմակերպման իրադարձությունները հաստատելու համար RDP4 ծրագրում օգտագործվել են վեց տարբեր ալգորիթմներ՝ տարբեր հիմնական բազմակի համեմատություններ անկախ ստուգելու համար: Համաշխարհային մասշտաբով, Գաբբինսի կողմից հայտնաբերված իրադարձությունների կեսից պակասը հաստատվել է RDP4-ի կողմից (աղյուսակներ 4 և 5): Հաշվի առնելով ամբողջ տվյալների հավաքածուն՝ հաստատվել են երեք ռեկոմբինացիոն իրադարձություններ, որոնցից երկուսը ներառում էին ներքին հանգույցներ, իսկ մյուսը՝ տերմինալ ճյուղի մեկ գենոմ, որի համար կլոնային համալիրներ չէին կարող վերագրվել (աղյուսակներ 4 և 5): Տերմինալ ճյուղերում իրադարձությունների նույնականացումը կարող է ցույց տալ, որ ռեկոմբինացիան դեռևս ընթացքի մեջ է ժամանակակից M. bovis շտամներում, կամ արդյունքը սխալ է տեղադրված70: Այս հիպոթետիկ ռեկոմբինացիոն շրջանում դիրքերի մոտավորապես 20%-ը ունեն չորոշված նուկլեոտիդներ (N), այդպիսով ազդելով ռեկոմբինացիոն ազդանշանի վրա (Լրացուցիչ նկար 2): Բացի այդ, այս շրջանը ազդում է rrs գենի վրա, որը կոդավորում է 16S ռիբոսոմային ՌՆԹ-ն, որը, ենթադրաբար, բարձր պահպանվածություն կունենա, ուստի այս ենթադրյալ ռեկոմբինացիայի ազդանշանը կարող է լինել հաջորդականության սխալների կամ անհամապատասխանության արդյունք։ Այնուհետև կատարվել է Mb0003-ի և Mycobacterium bovis AF2122/97-ի միջև ամբողջ գենոմի համապատասխանեցումը, և հաստատվել է չորոշված նուկլեոտիդների և SNP-ների գոյությունը, ուստի սխալ համապատասխանեցման հետ կապված հնարավոր խնդիրները պայմանավորված չեն այս աշխատանքում իրականացված կենսաբանական տեղեկատվությամբ։ Հայտնվել եմ ծրագիրը սովորելուց հետո։
Ներքին հանգույցների ռեկոմբինացիայի շրջաններում բացեր կամ չսահմանված նուկլեոտիդներ չեն հայտնաբերվել (Նկարներ 4 և 5): Այս իրադարձությունների վերաբերյալ, մեկը պարունակում է միայն Eu2 գենոմը և ազդում է pks12 գենի վրա, որը կոդավորում է հնարավոր պոլիկետիդ սինթազը, մինչդեռ մյուսը գրանցված է Eu1 գենոմում և ազդում է narX գենի վրա, որը կոդավորում է հնարավոր նիտրատ ռեդուկտազը (աղյուսակ 4): Ընդհանուր առմամբ, ռեկոմբինացիայի վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ ռեկոմբինացիայի բեկորների քանակը սահմանափակ է՝ վիճակագրական հիմնավորմամբ, և ենթադրյալ ցուցանիշները ցույց են տալիս, որ ռեկոմբինացիան ցածր ազդեցություն ունի M. bovis տոհմի վրա: Ռեկոմբինացիայի ազդանշանը, ենթադրաբար, ցածր կլինի, բայց կարևոր է տարբերակել իրական էվոլյուցիայի ազդանշանը ֆոնային աղմուկից, ինչը մարտահրավեր է: Հղման վրա հիմնված հավաքման և անհամապատասխանության խնդիրներով 70, 71 ներմուծված աղմուկի ազդանշանը նվազեցնելու համար մնացած բոլորը, բացառությամբ ամբողջական գենոմի, հավաքվել են զրոյից, և հավաքման որակը ստուգվել և ապահովվել է QUAST խողովակաշարային վերլուծությամբ (Լրացուցիչ աղյուսակ 1): Բացի այդ, իրականացվել են մի շարք լրացուցիչ վերլուծություններ՝ ընդհանուր հարցման հուսալիությունն ու ճշգրտությունն ապահովելու համար: Հետևաբար, narX և pks12 գեների հաջորդականության որակը գնահատվել է Mycobacterium bovis AF2122/97-ի նկատմամբ ընթերցման քարտեզագրման միջոցով: Ռեկոմբինացիայի շրջանում առաջարկվող SNP դիրքը հաստատվել է մեթոդի բաժնում նշված չափանիշների կիրառմամբ (առնվազն 20 ընթերցում և 0.9 փոփոխության հաճախականություն): NarX գենի պոլիմորֆիզմը լիովին հաստատվել է երկու գենոմներում (Mb1792361 և Mb7240415; 2.3%) և pks12 գենոմի գենոմներում՝ Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 և Mb12 գեներում: Սակայն, Mb2043 գենոմի համար ութ դիրքերից վեցը չեն համապատասխանում ընթերցման խորության չափանիշին, քանի որ SNP-ն ապահովվում է առավելագույնը 17 ընթերցմամբ, որը ցածր է սահմանված 20 սահմանային արժեքից: Հետևաբար, կարելի է հաստատել վեց գենոմների (8.6%) վերամիավորումը այս գենոմի հատվածում (Նկարներ 4 և 5):
Mycobacterium bovis տվյալների հավաքածուի ռեկոմբինացիոն շրջանի դասավորվածության մանրամասն վիզուալիզացիան ազդում է narX գենի վրա, որը կոդավորում է հնարավոր նիտրատ ռեդուկտազը: Ներքին հանգույցների ռեկոմբինացիոն շրջանում բացեր կամ չսահմանված նուկլեոտիդներ չեն հայտնաբերվել: Այս կոնկրետ իրադարձությունը գրանցված է Eu1 գենոմում: NarX գենի հաջորդականության որակը գնահատվել է Mycobacterium bovis AF2122/97-ի կարդացումները գծագրելով: Հաստատեք SNP-ի առաջարկվող տեղակայումը ռեկոմբինացիոն տարածքում՝ կիրառելով մեթոդի բաժնում նշված չափանիշները (առնվազն 20 կարդացում և 0.9 փոփոխության հաճախականություն): NarX գենի պոլիմորֆիզմը լիովին հաստատվել է Mb1792361 և Mb7240415 (2.3%) գենոմներում:
Mycoplasma bovis տվյալների բազայի pks12 գենի վրա ազդող ռեկոմբինացիոն շրջանի դասավորության մանրամասն վիզուալիզացիա: Ներքին հանգույցների ռեկոմբինացիոն շրջանում բացեր կամ չսահմանված նուկլեոտիդներ չեն հայտնաբերվել: Ինչ վերաբերում է հնարավոր պոլիկետիդ սինթազին կոդավորող pks12 գենի վրա ազդող իրադարձությանը, այն պարունակում է միայն Eu2 գենոմը: pks12-ի հաջորդականության որակը գնահատվել է Mycobacterium bovis AF2122/97-ի ընթերցման քարտեզագրման միջոցով: Հաստատեք SNP-ի առաջարկվող տեղակայումը ռեկոմբինացիոն տարածքում՝ կիրառելով մեթոդի բաժնում նշված չափանիշները (առնվազն 20 ընթերցում և 0.9 փոփոխության հաճախականություն): Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 և Mb1960 գենոմների պոլիմորֆիզմները լիովին հաստատվել են:
PE և PPE գեները ունեն կրկնվող շրջաններ, որոնք հեշտությամբ սխալ են կարդացվում Illumina-ի հաջորդականացման և սխալ քարտեզագրման միջոցով, ուստի դրանք սովորաբար ջնջվում են M. tuberculosis անդամների կենսաինֆորմատիկայի աշխատանքային հոսքից միայն հաջորդականությանը քարտեզագրման ռազմավարությունն օգտագործելիս: Այս աշխատանքում կիրառված ռեկոմբինացիայի իրադարձությունների եզրակացությունը հիմնված է de novo հավաքման վրա՝ առանց PE/PPE-ի զտման: Մենք կարծում ենք, որ SplitsTree-ի, Gubbins pipeline-ի և RDP4 ծրագրաշարի միջոցով երեք տարբեր լրացուցիչ մեթոդներ և ալգորիթմներ իրականացնելով՝ կիրառվող ռազմավարությունները կայուն են սխալի ազդանշանների պատճառով վերակազմակերպված շրջանները մշակելու և զտելու համար: Այնուամենայնիվ, SNP կլաստերները նույնականացնելու համար Gubbins և RDP4 ծրագրաշարի վրա PE/PPE գենի միջամտությունը բացառելու և, հետևաբար, narX և pks12 գեների վրա ազդող ռեկոմբինացիայի շրջանները նույնականացնելու համար ուսումնասիրվել է այս գեների հարևանությունը (Լրացուցիչ նկ. 3-5): M. bovis AF2122/97-ում narX գենը բաժանված է narK2-ով և Mb1764c-ով, մինչդեռ pks12-ը շրջապատված է Mb2075c և Mb2073c-ով (Լրացուցիչ նկար 3-5): Ամբողջական գենոմի MAUVE սինլինային քարտեզի միջոցով ստեղծված քարտեզը տեղեկատվություն է տրամադրում գեների հաջորդականության պահպանման և վերադասավորման մասին՝ ցույց տալով չորս կոլինեար բլոկներ և գենոմի տեղափոխման կամ ինվերսիայի նշանների բացակայություն: Բացի այդ, ամինաթթվային հաջորդականության հետ կոմպլեմենտացիայի վերլուծությունը ապացուցեց համանմանությունը բոլոր ամբողջական գենոմներում, և narX-ի կամ pks12-ի հարակից շրջաններում PE/PPE չի հայտնաբերվել: NarX-ի դեպքում մեկ գենոմը (Mb0030) ունի ավելի ցածր հոմանիշության միավոր, քանի որ narX գենը նույնականացվել է որպես երկու բեկոր (1891 և 1890 բեկորներ): pks12-ի դեպքում, նմանությունների պատճառով, Mb0030-ը և Mb003-ը ցուցաբերեցին ավելի ցածր սինգծայնության միավորներ, մինչդեռ pks12-ը նույնականացվեց համապատասխանաբար երկու և երեք բեկորներում, որոնք ներկայացնում էին սպիտակուցի տարբեր դոմեններ (Լրացուցիչ նկար 3-5): Հաշվի առնելով այս տեղեկատվությունը, և Gubbins-ի և RDP4 ծրագրաշարի կողմից երկուսն էլ իրականացված վերլուծությունը, պատուհանում առավելագույն 500 bp-ի հիմնական բազմակի դասավորվածությունը ստուգելով, մենք հաստատեցինք, որ PE/PPE գենը չի խանգարի narX-ի և pks12-ի վրա ազդող ռեկոմբինացիոն ազդանշանին:
Չնայած այս տվյալների հավաքածուում հայտնաբերված ռեկոմբինացիայի ազդանշանները կարող են համարվել մնացորդային, ճիշտ է, որ M. bovis-ի ռեկոմբինացիան չի կարող բացառվել, ուստի այն պետք է շարունակի լինել հետագա վերլուծության առարկա, որի ընթացքում տարբեր համաճարակաբանական սցենարներից ամբողջական գենոմները հաջորդականացվում են մինչև «Կարևոր»։
Ռեկոմբինացիայի ուղղումից առաջ և հետո ստացված ML ֆիլոգենետիկ ծառերի համեմատությունը (Նկար 2A, B) չի հանգեցրել ենթադրյալ ֆիլոգենետիկ կապի էական փոփոխությունների, և M. bovis շտամները խմբավորվել են նույն խմբում։
42 նոր հաջորդականացված M. bovis կարդացումները M. bovis AF2122/97-ի հղման գենոմի հետ քարտեզագրելուց հետո ստացվել է SNP-ների համընկնում, որը պարունակում է 1816 պոլիմորֆ դիրքեր: SNP-ների մեծ մասը (87.1%) գտնվում է կոդավորող շրջանում, և ազդակիր գեները բնութագրվում են Bovilist-ում ներկայացված ֆունկցիոնալ կատեգորիաների համաձայն (Նկար 6A, B): Հաշվի առնելով յուրաքանչյուր ֆունկցիոնալ կատեգորիայի գեների ընդհանուր թիվը՝ «լիպիդային նյութափոխանակություն» կատեգորիայի գեները ցույց են տվել ավելի շատ SNP-ներ, որին հաջորդում են «բջջային պատի և բջջային գործընթացների» և «միջանկյալ նյութափոխանակության և շնչառության» գեները, ինչը ցույց է տալիս, որ դրանք գտնվում են M. bovis-ի էվոլյուցիայի մեջ:
Պորտուգալիայից ստացված M. bovis տվյալների բազայի հիերարխիկ վերլուծություն (n = 42): Յուրաքանչյուր ֆունկցիոնալ կատեգորիայի համար գրանցված SNP-ների և ազդակիր գեների ընդհանուր թիվը (A): Ֆունկցիոնալ կատեգորիայի կողմից գրանցված հոմանիշ և ոչ հոմանիշ փոփոխությունների ընդհանուր թիվը (B):
Համաշխարհային մասշտաբով dN/dS միջին հարաբերակցությունը 1.5-ից լավ է, ինչը ցույց է տալիս, որ գլոբալ էվոլյուցիոն ճնշումը նախնիների վիճակից ազատվելն է և ներկայացնում է դրական (դիվերսիֆիկացված կամ ուղղորդված) և/կամ թուլացած մաքրման ընտրության սցենար: «Վիրուլենտություն, դետոքսիկացիա, ադապտացիա», «ներդրման հաջորդականություններ և ֆագեր» և «կարգավորող սպիտակուցներ» կատեգորիաներում SNP-ների ավելի քան երկու երրորդը ոչ հոմանիշ են (Նկար 6Բ):
Բոլոր կատեգորիաներում կան գեներ բազմաթիվ SNP-ներով, ինչի արդյունքում միջին մուտացիայի մակարդակը (այսինքն՝ մեկ գենի միջին SNP-ն) մեծ է 1-ից (Նկար 6Ա): 15 SNP-ով Pks12 (Mb2074c)-ը և 8 SNP-ով fas (Mb2553c)-ը ունեն ավելի բարձր մուտացիայի արժեքներ: Այս երկու գեներն էլ մասնակցում են ճարպաթթուների նյութափոխանակությանը: pks գենը կոդավորում է պոլիկետիդ սինթազին (PKS), որը բազմաֆունկցիոնալ ֆերմենտ է, որը մասնակցում է միկոբակտերիայի բջջային պատի լիպիդների կենսասինթեզին74,75: Այս գենը կոդավորում է բազմաֆունկցիոնալ պոլիպեպտիդ, որը մասնակցում է միկոկետիդների սինթեզին74,76: fas գենը մասնակցում է միկոլիկ թթվի սինթեզին: Այս երկու գեներն էլ կարևոր դեր են խաղում բջջային պատի կենսասինթեզում՝ տիրոջ հետ շփման մեջ:
Mycobacterium bovis-ի էվոլյուցիան ավելի խորը ուսումնասիրելու համար վերլուծվել են երկու հատուկ գեների հավաքածուներ: Նախկինում հրապարակված աշխատանքներում, որոնք օգտագործում են հաջորդականության կազմ և ֆիլոգենետիկ մեթոդներ, նույնականացվել են գեներ, որոնք MTBC նախնիները ձեռք են բերել HGT-ի միջոցով՝ դիվերսիֆիկացիայից առաջ37,38: Այս գեները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 2-ում: Վերլուծվել է HGT-ի հետ կապված ընդհանուր 77 գենի SNP բաշխումը, և նույնականացվել են 26 պոլիմորֆ տեղամասեր, որոնք դեպքերի մեծ մասում (78%) հանգեցրել են ոչ հոմանիշ (NS) փոփոխությունների (Լրացուցիչ աղյուսակ 2): MTBC գենոմի վերաբերյալ նախորդ աշխատանքները ցույց են տվել, որ ենթադրյալ HGT շրջանը ցուցաբերում է ավելի բարձր NS SNP հարաբերակցություն՝ համեմատած գենոմի մնացած մասի հետ: Եթե կարծում ենք, որ այս ռեկոմբինացիոն շրջանները ձեռք են բերվել MTBC նախնիների կողմից, և, հետևաբար, դրանք գերակշռում են հին պոլիմորֆիզմներին, ապա հոմանիշ փոփոխությունների համամասնությունը, ենթադրաբար, ավելի բարձր կլինի, քանի որ NS փոխարինումները, ենթադրաբար, կվերացվեն բացասական ընտրության միջոցով, քանի որ ամինաթթվային փոփոխությունները կարող են փոխել սպիտակուցի գործառույթը: Հետևաբար, մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ֆունկցիոնալ հետևանքները կարող են բխել HGT-անման գեների փոխարինումից, ինչը արտացոլում է դրանց կարևորությունը արժեքավոր ադապտիվ գենետիկական բազմազանության համար։
Այս վերլուծությանը զուգահեռ, 3R (ԴՆԹ-ի վերականգնում, վերարտադրություն և ռեկոմբինացիա) համակարգի բաղադրիչները կոդավորող գեները մանրակրկիտ ուսումնասիրվել են՝ համաձայն դոս Վուլտոսի և նրա համագործակիցների (2008)39 կողմից նախկինում հրապարակված ցանկի։ Նույնական ԴՆԹ բեկորների փոխանակումը հնարավոր չէ ուղղակիորեն դիտարկել, չնայած դա կարող է հաճախակի գործընթաց լինել, երբ ներգրավված են սերտորեն կապված մանրէներ, ինչպես այս տվյալների հավաքածուի դեպքում։ Բացի այդ, այս գործընթացը կարող է լինել ԴՆԹ-ի վերականգնման մեթոդների բանալին72, ուստի դեր է խաղում հոմոլոգ ռեկոմբինացիայում։ Հայտնաբերվել է ընդհանուր առմամբ 26 պոլիմորֆ դիրք, որոնք բաշխված են 54 գեների վրա (Լրացուցիչ աղյուսակ 3)։ Այս գեների հավաքածուում NS փոփոխությունները կազմել են հետևանքների մոտ 65%-ը, ինչը համապատասխանում է Mycobacterium tuberculosis շտամների վերաբերյալ նախորդ զեկույցներին։
Հրապարակման ժամանակը. Հոկտեմբերի 21-2021