הערכות כלל-גנומיות של רקומבינציה, מוטציה וסלקציה חיובית מעוררות השראה למגוון גורמים המניעים את Mycobacterium bovis

תודה שביקרתם באתר Nature. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסה חדשה יותר של הדפדפן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). במקביל, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג אתרים ללא סגנונות ו-JavaScript.
ריצוף גנום החיה את תחום חקר המחלות הזיהומיות, וחשף אפידמיולוגיה של מחלות, פתוגנזה, יחסי גומלין בין מארח לפתוגן והתהליך האבולוציוני המוטל על פתוגנים. קומפלקס Mycobacterium tuberculosis (MTBC) רואה ב-Mycobacterium bovis אחד מחבריו האדפטיביים בבעלי חיים הגורמים לשחפת (TB) ביונקים יבשתיים, והוא מודל טיפוסי לאבולוציה חיידקית. כמו חברי MTBC אחרים, Mycobacterium bovis נחשב לפתוגן משובט לחלוטין, המתפתח באיטיות, וברור שאין סימן לרקומבינציה או העברת גנים אופקית. בעבודה זו, אנו מיישמים גנומיקה השוואתית על מערך נתונים של רצף גנום שלם (WGS) המורכב מ-70 בקר M. משושלות שונות (אירופה ואפריקה) כדי לקבל תובנות לגבי המגוון הגנטי של בקר M. כוח אבולוציוני. שלוש שיטות שונות משמשות להערכת סימני הארגון מחדש. ברחבי העולם, מספר קטן של אירועי רקומבינציה זוהו ואושרו על ידי שתי שיטות בלתי תלויות עם תמיכה מוצקה. עם זאת, בהשוואה למוטציות, לרקומבינציה יש השפעה חלשה יותר על המגוון של M. bovis (r/m כולל = 0.037). ההבדל בממוצע r/m שהתקבל בקומפלקס השיבוטי של Mycobacterium bovis במערך הנתונים שלנו עולה בקנה אחד עם התפיסה הכללית שמידת הרקומבינציה עשויה להשתנות במידה רבה בין השושלות המשויכות לאותו מין טקסונומי. בהתבסס על עבודה זו, לא ניתן לשלול רקומבינציה ב-Mycobacterium bovis, ולכן היא צריכה להיות נושא למאמצים נוספים במחקר גנומי השוואתי עתידי, שבו ניתוח נתונים של מערכי נתונים גדולים מתרחישים אפידמיולוגיים שונים ברחבי העולם הוא קריטי. לאחר מכן בוצע ניתוח נוסף על מערך הנתונים הקטן יותר של Mycobacterium bovis (n = 42) משכיחות שחפת מרובת מארחים, וזוהו יותר מ-1,800 לוקוסים, מתוכם לפחות זן אחד הראה פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP). רובם (87.1%) ממוקמים באזור הקידוד, והיחס הגלובלי של שינויים לא-סונימיים (dN/dS) של שינויים סונימיים עולה על 1.5, דבר המצביע על כך שברירה חיובית היא כוח אבולוציוני חשוב המופעל על M. bovis. שיעור גבוה יותר של SNPs זוהה בגנים עשירים בקטגוריות פונקציונליות של "מטבוליזם שומנים", "דופן תא ותהליכים תאיים", ו"מטבוליזם ביניים ונשימה", מה שחושף את הפוטנציאל שלהם בביולוגיה ובאבולוציה של חשיבות Mycobacterium bovis. מבט מקרוב על הגנים באבות MTBC הנוטים להעברת גנים אופקית וכלולים במערכת 3R (תיקון DNA, שכפול ורקומבינציה) מגלה את הערך השלילי הממוצע הגלובלי של מבחן הניטרלי D של טאיג'ימה, המצביע על סריקה סלקטיבית בעבר. צוואר הבקבוק האחרון לאחר הרחבת האוכלוסייה הוא עדיין הגורם המניע האבולוציוני העיקרי עבור הפתוגן המחייב Mycobacterium bovis להילחם בפונדקאי.
קומפלקס Mycobacterium tuberculosis (MTBC) הוא אחד המינים המוצלחים ביותר של פתוגנים חיידקיים ומקרה טיפוסי של אבולוציה חיידקית. חבריו מראים זהות נוקלאוטידית גבוהה באופן מפתיע ברמה הגנומית (> 99%)1,2. אקוטיפים שונים של MTBC יכולים לגרום לשחפת (TB), שהיא מחלה גרנולומטוטית מדבקת, במגוון רחב של מיני פונדקאים, מיונקים זעירים ועד בני אדם3,4,5. נכון לעכשיו, הקומפלקס כולל בני אדם [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] ופתוגנים המותאמים לבעלי חיים (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" ו-"dassie")5,6. M. canettii (הידוע גם בשם "Nodobacter glabrata") זהות הנוקלאוטידים הממוצעת עם המיקובקטריה הנ"ל היא 98%, ועבודות גנומיקה השוואתיות הראו ש-M. canettii ושאר MTBC התרחקו לאחרונה מהאב הקדמון המשותף.7 בהתחשב במושג זה, ישנם מחברים המכנים את M. canettii חבר ב-MTBC 8.
MTBC מתואר באופן שיטתי כקומפלקס שבטי קפדני, ומבנה האוכלוסייה שלו נשלט בבירור על ידי גיוון מופחת, צווארי בקבוק, סריקה סלקטיבית וסחיפה גנטית9,10. בהנחה שאבולוציה שבטית קפדנית מורכבת, כגון פולימורפיזמים חסרים, אינה ניתנת לשחזור באמצעות רקומבינציה. בהתבסס על הנחה זו, האירועים העוקבים של המחיקה הגנומית של האזור הדיפרנציאלי (RD) ו-TbD1 (אזור מחיקה ספציפי 1 ל-Mtb) הוצעו כסמנים מולקולריים של התפתחות MTBC2,5,11. עבודת גנומיקה השוואתית וריצוף גנום שלם (WGS) תומכת בחלוקה של חברים המותאמים לבני אדם לתשע שושלות (Mycobacterium tuberculosis L1 עד L4, L7 ו-L8; ו-Mycobacterium africanum L5, L6 ו-L9), שושלות L2 עד L4 חולקות אזור מחיקה משותף של TbD12,11,12,13. בנוסף, מוצע כי לחברים המותאמים לבעלי חיים יש אב קדמון משותף, המוגדר על ידי מחיקות ספציפיות לקלאד ב-RD7, RD8, RD9 ו-RD102, 5 ו-14.
אירועי העברת גנים אופקית (HGT) ורקומבינציה נחשבים לנדירים ומתרחשים באבותיהם של MTBC, ולא בהיסטוריה השונה של כל חבר ה-MTBC15,16,17. שני דיווחים מוקדמים של יוז ועמיתיו (2002) וגוטקר ועמיתיו (2006) הציעו שאירועי רקומבינציה עשויים לסייע בעיצוב פולימורפיזמים המסמנים לוקוסים ספציפיים בזני M. tuberculosis18,19. הסיבות לחוסר הברור של רקומבינציה ב-MTBC הן: (1) התהליך המכני ואובדן היכולת של HGT; (2) נדירותם של אירועי HGT; (3) אין סיכוי לאירועי רקומבינציה בנישה של MTBC14,17. לאחרונה, מספר מחקרי ריצוף גנום שלם (WGS) שהוחלו על זן MTBC 20 ו-Mycobacterium bovis 21 סיפקו ראיות לרקומבינציה, הראשונים שהראו שזני MTBC מחליפים לעתים קרובות שברי DNA קטנים, אך עקב שונות מוגבלת ברצף נוקלאוטידים, אירועים אלה עדיין לא מורגשים.
Mycobacterium bovis הוא חבר ה-MTBC הנפוץ ביותר שנמצא בבעלי חיים (בעיקר בקר), אם כי ניתן לבודד אותו גם מחיות בר חופשיות ומגודרות4,22,23,24. M. bovis התפתח לחמישה קומפלקסים שבטיים עיקריים [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) ו-Africa 2 (Af2)], בהתאם לפרופיל הספוליגוטיפינג, מחיקות ספציפיות ופולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs)25, 26, 27, 28, 29 בגנים ספציפיים. קומפלקסים שבטיים אלה מדגימים את המבנה המגוון של אוכלוסיית Mycobacterium bovis ואת הקשר שלה לאזורים גיאוגרפיים. בנוסף, עבודת ה-WGS האחרונה שבוצעה על ידי זימפל ועמיתיו (2020) עיצבה פילוגניה המבוססת על ה-SNP של Mycobacterium bovis, עם יותר מ-1,900 גנומים, דבר המצביע על כך שיש לפחות ארבע שושלות שונות (בשם Lb1 עד Lb1 עד Lb4). הן אינן תואמות לחלוטין את הקומפלקס השיבוטי שהוגדר קודם לכן, אם כי ניתן גם לאשר ספציפיות גיאוגרפית. מחברים אלה ביצעו ניתוח דיפרנציאלי של פילוגניה ותיארוך מולקולרי, אך לא חקרו רקומבינציה.
עבודות קודמות שהשתמשו בטכניקות מולקולריות שונות, כגון ספוליגוטיפינג, MIRU-VNTR (Mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), וטיפיזציה של SNP לאחרונה חשפו רמה מסוימת של גיוון גנטי בקרב זני M. bovis 31,32,33, 34,35. ההתמיינות של שונות גנטית הפכה לכלי חשוב בחקר האפידמיולוגיה של מחלות, דבר המסייע להבנה מעמיקה של פתוגנזה, אלימות והעברת מחלות. הופעתה של שיטת WGS מספקת את האפשרות לחשוף את גורמי המניע האבולוציוניים המוטלים על ידי הגנום של Mycobacterium bovis בתהליך ההסתגלות וההתמדה לפונדקאים ותרחישים אפידמיולוגיים שונים.
בעבודה זו, אנו משתמשים בניתוח גנומי השוואתי על מערכי נתונים שונים של Mycoplasma bovis (n=70), כולל מבודדים מקומפלקסים שבטיים שונים, כדי לקבל תובנות לגבי התהליך האבולוציוני של Mycoplasma bovis, במיוחד כדי לפתור קשרים פילוגנטיים ואירועי רקומבינציה. כתוספת לניתוח זה, נחקרה עוד מערך נתונים משנה של מבודדי M. bovis (n = 42) שהתקבלו מאזור שחפת מרובה-פונדקאים מאופיין היטב בפורטוגל 31,36 כדי להסיק אי-זהות. האיזון בין היחס היחסי בין החלפות נוקלאוטידים במובן (dN) לבין החלפות נוקלאוטידים סינוניות (dS), כמו גם התרומה האבולוציונית של גנומים ספציפיים המוזכרים בספרות, הם 37,38 התקבלו על ידי אבות MTBC באמצעות HGT, ומקודדים רכיבי גנים של מערכת 3R (תיקון DNA, שכפול ורקומבינציה) 39. בחרו גנים שהתקבלו באמצעות HGT מכיוון שהם עשויים לייצג פולימורפיזמים עתיקים, ולכן צפוי שהם עשויים להכיל שיעור גבוה יותר של שינויים סינוניים. הגנים הכלולים במערכת 3R נבחרו משום שעבודות קודמות על זני M. tuberculosis הצביעו על סלקציות שליליות/טיהור כלליות שפועלות על גנים אלה, וייתכן שהן ממלאות תפקיד חשוב באבולוציה 39. מטרה נוספת של עבודה זו היא להסיק את קיומם של אירועי רה-ארגון. מסיבה זו, בהתחשב בכך שמערך הנתונים שלנו מפורטוגל מכיל רק את הגנומים של קומפלקס השיבוט האירופי 2 ואת הזנים שלא הקצו להם את קומפלקס השיבוט, החלטנו לכלול נתוני גנום זמינים לציבור כדי לקבל סוף סוף מייצג של כל קומפלקסי השיבוט, ולשפר את החוסן ורוחב התוצאות.
42 גנומים חדשים של Mycoplasma bovis מזירת השחפת הרב-מארחית האנדמית בפורטוגל (פרטים בהמשך), שאופיינו בעבר מנקודת מבט אפידמיולוגית36, הם מרכז עבודה זו. בהתחשב בכך שמערך הנתונים מפורטוגל מכיל רק נציגים של שני קומפלקסים של שיבוטים אירופיים וזנים ללא קומפלקסים ייעודיים, נוספו נתוני ריצוף גנום שלם הזמינים לציבור כדי להרחיב את מערך הנתונים הכולל את כל נציגי קומפלקסי השיבוט של M. bovis. לכן, נעשה שימוש בשלושה מקורות נתונים של ריצוף גנום שלם בעבודה זו: הרכבת גנום מלאה/טיוטה, עד 10 פיגומים המאוחסנים ב-NCBI (המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה) (n = 15 בידודים); מאוחסן ב-SRA (קובץ Illumina fastq של ארכיון קריאת הרצף) מייצג את המגוון המורכב של שיבוטי M. bovis (n = 12 בידודים)30; ו-42 גנומים חדשים מפורטוגל. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) לא הוצא מחיפוש NCBI. M. bovis AF2122/97 משמש בדרך כלל כגנום ייחוס שיש לכלול במערך הנתונים. עקב חוסר הזמינות הציבורית של רצף הגנום המלא המיוצג על ידי קומפלקס השיבוט African 1, ומספר הגנומים הקטן מזנים מייצגים של Af2 ו-Eu1, נעשה שימוש במקרים אלה בנתוני הריצוף המקוריים שסופקו על ידי SRA. עבודתם של Zimpel ועמיתיו (2020) סייעה בזיהוי הגנום מקומפלקס השיבוט הנ"ל וסייעה בבחירת Mycobacterium bovis להכללה במערך הנתונים. עבור Eu3, מתואר רק סוג אחד של גנום (Branger et al., 2020), כך שהגנום שאנו כוללים הוא נציג נפרד של קומפלקס Eu3.
ברחבי העולם, מערך נתונים זה כולל 70 מינים של M. bovis בבקר שבודדו מ-8 מיני פונדקאים, המופצים ב-12 מדינות בין השנים 1985 ל-2016. 36 מינים מסווגים כ-Eu2, 7 מינים הם Eu1, מין אחד הוא Eu3, 3 מינים הם Af1, 4 מינים הם Af2 ו-19 אינם מיוחסים לקומפלקס שבטי כלשהו (פרטים נוספים בהמשך). המידע המפורט (כולל מספר הגישה) של Mycobacterium bovis ששימש במחקר זה מוצג בטבלה 1 ובטבלה המשלימה 1.
42 גנומים שלמים שרוצפו לאחרונה של Mycobacterium bovis ממוקדי שחפת בבעלי חיים בפורטוגל והופצו במשך יותר מ-12 שנים הם מרכז המחקר הזה, שכן מערכות פוטנציאליות של מחלות חיות בר-בעלי חיים נוטרו באופן קבוע 31,36 (איור משלים 1). על פי נהלים עוקבים, זנים אלה בודדו מבקר (n = 14), צבאים אדומים (n = 16) וחזירי בר (n = 12) בין השנים 2003 ל-2015: נאספו וטיפלו בבעלי חיים בהתאם להנחיות הפרוטוקול המומלצות. דגימות הרקמה נמצאות במדריך בעלי החיים היבשתיים של ה-OIE ומחוסנות על מצע מוצק ומדיום נוזלי פירובט של Stonebrink ו-Löwenstein-Jensen. התרביות מודגרות ב-37 מעלות צלזיוס והצמיחה נבדקת פעם בשבוע למשך 12 שבועות לפחות. המושבות מאוחסנות ישירות בתמיסת גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס. במדיום הסלקטיבי Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), הדגימות המקוריות שנשמרו עברו דרך מעבר יחיד in vitro in vitro כדי להשיג את ה-DNA של תוכנית WGS. לשם כך, תמיסת הגידול הקפואה הועשרה ב-5% נתרן פירובט ו-10% ADS (50 גרם אלבומין, 20 גרם גלוקוז, 8.5 גרם נתרן כלורי בליטר מים אחד) על גבי Middlebrook 7H9 ב-37°C Retrain. לאחר 4 שבועות של גידול, המדיום חודש והתרבות נוטרה באופן קבוע עד שנצפו גידולים. התאים נאספו באמצעות צנטריפוגה, הגלולה הושעתה מחדש ב-500 מיקרוליטר תמיסת מלח פוספטית (PBS), חוממה ב-99°C למשך 30 דקות, עברו צנטריפוגה, והסופרנטנט אוחסן ב-20°C- עד ל-WGS. כל ההליכים מבוצעים במתקני בטיחות ביולוגית ברמה 3.
ספריית הגנום הזוגית של WGS מוכנה באמצעות האינדקס הייחודי של כל דגימת DNA, ומשתמשת בטכנולוגיית Illumina MiSeq (2 × 250 פיברגלס) (40 דגימות) ו-HiSeq (2 × 150 פיברגלס) (שני דגימות) (Eurofins Genomics, גרמניה) לצורך ריצוף. בהתאם להוראות היצרן, יש להשתמש ב-Illumina Genome Analyzer עם מודול דו-קצוות כדי לרצף את ה-DNA הגנומי, ולהשתמש בערכת Nextera XT DNA Library Prep Kit של Illumina כדי לבנות את הספרייה.
בהתחשב בנתונים שנאספו מ-SRA (n = 12), ניתן להשתמש בזיהוי קומפלקס השיבוט כמטא-דאטה של ​​הפרסום המתאים 30, 41, 43. כאשר בוחנים את הגנום המלא, למעט Mycobacterium bovis AF2122/97 ו-Mycobacterium bovis 3601, שהם חברים מוכרים בקומפלקס השיבוטי Eu1 ו-Eu3 25, 29, בהתאמה, הוא זהה לגנום המלא של Mycobacterium tuberculosis H37Rv (מספר גישה של NCBI NC_000962.3). יישור הגנום מתבצע באמצעות MAFFT (תוכנית יישור מרובה של רצף חומצות אמינו או נוקלאוטידים, גרסה 7.458) ופרמטר -addfragments 48. לאחר מכן, חפשו היעדר קומפלקסים שיבוטיים שונים ו/או נוכחות של מאפייני SNP.
ה-Mycobacterium bovis שרוצפה לאחרונה (n = 42) והקריאות המקוריות של טיוטת הגנום שהורכבה (n = 3) מיישרות את הקומפלקס עם גנום הייחוס Mycobacterium tuberculosis H37Rv דרך צינור vSNP ונוכחות של מחיקה ו/או מאפייני SNP של שיבוטים שונים. נערך חיפוש.
איסוף מידע מחוסר מאפיינים ו/או נוכחות/היעדר SNP ופרופילי ספוליגוטיפינג כדי להקצות נתונים גנומיים לקומפלקס השבטי המתאים. עבור ארבעת מכלולי הטיוטה, לא ניתן להסיק את פרופיל הספוליגוטיפינג, ולכן הם נכללים בקבוצה "ללא מורכבות".
תהליך העבודה הביואינפורמטית שאחריו עבודה זו מתחיל בהרכבה דה נובו ומיפוי לאסטרטגיית ייחוס, במטרה לחקור אירועי רקומבינציה ופולימורפיזמים ספציפיים של הגנום. איור 1 מציג תרשים זרימה של השלבים הבאים. לצורך ניתוח רקומבינציה, כל הגנומים משמשים להגברת החוסן של ההסקות והאינדיקטורים הקשורים.
על מנת להפחית שגיאות ביצירת רצפי קונצנזוס של גנום, תחילה השגנו הרכבה דה נובו, ולאחר מכן השגנו יישורים מרובים של הליבה. צינור Unicycler זמין כעת בכתובת https://github.com/rrwick/Unicycler49 ומשמש לביצוע הרכבה דה נובו של 54 גנומים מרוצפו (42 קבצי מרוצפו חדשים ו-12 קבצי fastq ששוחזרו מ-SRA). בקצרה, לפני ההרכבה מאפס, בוצע ניתוח איכות הקריאה ב-FastQC גרסה 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), וב-Trimmomatic גרסה 0.36 (מוחלים האפשרות "חיתוך מתאמים ורצפים ספציפיים לתאורה אחרים מקריאות" ו"חיתוך בסיסים מסוף הקריאה, אם איכות הסף נמוכה יותר מ-20") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. לאחר מכן, SPAdes optimizer49 שימש להרכבת הגנום, ו-Pilon גרסה 1.1851 שימשה לאופטימיזציה לאחר ההרכבה. נבחר מצב גישור שמרני כדי למנוע הרכבה שגויה, וגודל ה-k-mer חיפש ונבחר בין 20% ל-95% מאורך הקריאה. יש לפעול לפי הנחיות SPAdes ולקחו בחשבון את גודל הקריאה, למחוק קונטיגים קטנים מ-300 bp, ולקבוע גבול כיסוי עומק של 52 קריאות של 20 קריאות. באסטרטגיית ההרכבה de novo, אזורים גנומיים כגון הפרלוגים של פרולין-גלוטמט (PE) ופרולין-פרולין גלוטמט (PPE) החוזרים מאוד לא הוסרו.
איכות ההרכבה de novo מוערכת באמצעות צינור QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), אשר מאפשר את חידוש הקונטיג ואת מיפוי הגנום הייחוס M. bovis AF2122/97 (מספר גישה של NCBI LT708304.1) (ראה טבלה משלימה 1 עבור פרמטרי איכות).
בעזרת צינור vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), קובץ ה-FASTQ של M. bovis שזה עתה רוצף מריצוף Illumina מושווה לגנום הייחוס AF2122/97 של M. bovis (LT708304.1)). בהתאם להמלצות שיטות העבודה המומלצות של ערכת כלי ניתוח הגנום (GATK) [53, 54, 55], יש להחיל פרמטרי סינון סטנדרטיים או ציוני מסה וריאנטיים לצורך כיול מחדש. התוצאות מסוננות באמצעות ציון המסה הנמוך ביותר של SAMtools של 150 ו-AC = 2. כמו כן, יש להשתמש ב-Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) כדי לבדוק את הקריאות ולשלול זיהום. צינור vSNP המשמש למיפוי לאסטרטגיות ריצוף בעבודתנו בוחן סדרה של SNPs ומטרות מוגדרות, וגם לא כולל תרחישי זיהום מעורבים. כיסוי הגנום שנקרא טוב מ-99% (טבלה משלימה 1).
כדי להימנע משגיאות מיפוי ו-SNPs שגויים, יש לסנן וריאנט במקרים הבאים: (1) הוא נתמך על ידי פחות מ-20 קריאות, (2) הוא נמצא בתדירות של פחות מ-0.9, (3) הוא נמצא לפחות בזן אחד, אך לפחות ישנם פערים בזן אחר. מציג הגנומיקה המשולב (IGV) גרסה 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 שימש לאימות חזותי של SNPs ומיקומים עם בעיות מיפוי או יישור. מכיוון שהגנים של פרולין-גלוטמט (PE) ופרולין-פרולין גלוטמט (PPE) משוכפלים מאוד והם חלק ממשפחה מרובת גנים, הם קלים לאי-הבנה על ידי ריצוף ומיפוי שגוי של Illumina, ולכן הם מועדפים. תהליך העבודה של ביואינפורמטיקה של מיקובקטריאלים הסיר חברים בקומפלקס השחפת בעת שימוש באסטרטגיית מיפוי לרצף כדי לאשר SNPs. לכן, סיננו גנים ו-indels של PE/PPE מהניתוח.
לפי Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), כל ה-SNPs מחולקים לקטגוריות פונקציונליות. צינור SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) משמש להסקת השלכות של SNPs (שינויים סינונימיים או לא סינונימיים). נוצר מסד נתונים חדש של גנום Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
יישור מרובה של גנום הליבה בוצע באמצעות Parsnp גרסה 1.2, הזמינה כעת בכתובת https://github.com/marbl/parsnp57, תוך שימוש ב-69 גנומים/הרכבות טיוטה שלמים (עם אפשרות -c) ו-M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) משמש כנקודת ייחוס. בוצעו ארבעה יישורים מרובה ליבה: רק חברי קומפלקס השיבוט Eu2 (n = 37), כולל כל חברי קומפלקס השיבוט האירופי (n = 44), כולל נקודת הצומת של קומפלקס השיבוט האירופי והאפריקאי (n = 51), וכל Mycobacterium bovis במחקר זה (n = 70).
יישור הליבה שנוצר על ידי Parsnp משמש להסקת עץ פילוגנטי בעל סבירות מקסימלית (ML) באמצעות CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 תוך שימוש ב-RAxML, ולביצוע 1000 חזרות מודרכות.
שלושה אלגוריתמים וכלים ביואינפורמטיקה שונים משמשים לבדיקת נוכחות של אירועי רקומבינציה במקביל: תוכנת SplitsTree4, צינור Gubbins (שושלת בלתי מוטה דרך רקומבינציה ברצפי נוקלאוטידים), ותוכנת RDP4 (תוכנית לגילוי רקומבינציה, גרסה בטא 4.101).
שיטת הפירוק המפוצל המיושמת ב-SplitsTree4 גרסה 4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 משמשת לחישוב הרשת הפילוגנטית חסרת השורשים, תוך שימוש במבחן Phi לאימות סטטיסטי, וסף המובהקות הוא p = 0.05. ניתוח הליבה הרב-יישורי של Parsnp משמש כקלט, ופירוק הפיצול כסטנדרט רשת ממומש.
צינור Gubbins גרסה 2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) פועל עם פרמטרים ברירת מחדל כדרך נוספת להעריך את השפעת הרקומבינציה על Mycobacterium bovis. האלגוריתם הממומש בצינור משחזר את שושלת השיבוט הרלוונטית. הגנום/הרכבת הטיוטה המלאה של מערך הנתונים שלנו וגנום הייחוס (בקר AF2122/97, LT708304.1) מחוברים זה לזה; וסורקים את מיקום ה-SNP על כל ענף של העץ כדי לזהות את אשכול ה-SNP המייצג את אירוע הרקומבינציה. האפס של הענף נניח שאין אירוע רקומבינציה, מה שאומר שה-SNPs המתרחשים על הענף צריכים להיות מפוזרים באופן שווה. יישור הליבה המרובה מ-Parsnp ועץ ה-ML בעל הציון הטוב ביותר מ-RAxML משמשים כקבצי קלט.
לבסוף, על מנת לאשר את אירוע הארגון מחדש שהוצע על ידי צינור Gubbins, ששת האלגוריתמים המיושמים ב-RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ו-SiScan66) מוחלים על היישור המרובה של הליבה של Parsnp תחת הגדרות ברירת מחדל. קבענו שלפחות שלושה מהאלגוריתמים המיושמים ב-RDP4 חייבים להדגים באופן עקבי אות חשוב כדי לאמת כל אירוע רקומבינציה.
בהתחשב בכך שגם תוכנת Gubbins וגם תוכנת RDP מחפשות אותות רקומבינציה על ידי בדיקת יישורים מרובים של הליבה בחלון של עד 500 בסיסים, ואישור שהכללת גנים של PE/PPE במהלך הרכבה de novo לא תפריע לאותות הרקומבינציה שנמצאו, ניתוח נוסף מתבצע באמצעות בדיקת הומולינאריות של הסביבה של הגן המזהה את אירוע הרקומבינציה. המפה הסינליניארית המשתמשת בגנום המלא נבנתה באמצעות יישור MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) כדי לא לכלול טרנסלוקציות או היפוכים מקומיים של גנום. בנוסף, הגנום כולו שימש לביצוע ניתוח הומולינאריות על רצף חומצות האמינו דרך שרת האינטרנט SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
ניתוח מעמיק יותר של מערך נתוני הגנום שהתקבל ממערכת שחפת מרובת הפונדקים הפורטוגזית נועד לבדוק את הפולימורפיזם של הגנים המוזכרים בספרות. גנים אלה הם 37, 38 והגן המקודד ל-3R שהתקבל על ידי אבות MTBC באמצעות רכיבי מערכת HGT (תיקון, שכפול ורקומבינציה של DNA) 39. השתמש ב-ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) וב-DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) כדי לחשב את גיוון הגנים וגיוון הנוקלאוטידים (π) ואת קלט פרמטר הבדיקה הנייטרלי של Tajima.
התקבל עץ פילוגנטי בעל סבירות מרבית (ML) המבוסס על 69 בידודים של Mycoplasma bovis וגנומים ייחוס (איור 2A). בהשוואה לעצים מבוססי גן יחיד או עצים מבוססי לוקוסים מרובים, אסטרטגיה זו מאפשרת יצירת עצים חזקים יותר שאינם לוכדים את השונות של הגנום כולו ולכן מפגינים יכולת נמוכה יותר להבחין בין מינים 68,69. המבנה הטופולוגי של עץ ה-ML עולה בדרך כלל בקנה אחד עם הסיווג המורכב של שיבוטים. הגנום של Eu2 מקובץ בענף, וגם הגנום של Af1 מקובץ יחד (איור 2A). התוצאה עולה בקנה אחד גם עם הקשר האבולוציוני הידוע של Mycobacterium bovis, כלומר, יש הבדל גדול בין חבר Eu1 לקבוצה המורכבת מכל שאר הקומפלקסים והגנומים השיבטיים, אך הקומפלקס השיבטי 30 אינו מוגדר. את חוסר העקביות הקטן בין הקומפלקס השיבוטי לבין הקשר שנצפה בעץ הפילוגנטי ניתן להסביר על ידי העובדה שהקומפלקס השיבוטי מתואר על סמך אזורים גנומיים ספציפיים, בעוד שהעץ הפילוגנטי מבוסס על יישורים מרובים של גנומים מרכזיים המייצגים את הגנום כולו.
עץ הפילוגנטיקה בעל הסבירות המרבית (GTR) בנוי על סמך יישור הגנום המרכזי של גנום Mycobacterium bovis לפני (A) ואחרי (B) הסרת אתר הרקומבינציה. צבעי הענפים מייצגים את קומפלקס השיבוט של Mycobacterium bovis: אירופה 1 היא סגולה, אירופה 2 היא אדומה, אירופה 3 היא כחולה, אפריקה 1 היא כתומה ואפריקה 2 היא ירוקה. העץ מושרש ומצויר בקנה מידה, ואורך הענף נמדד כתחליף לכל אתר.
קומפלקס Mycobacterium tuberculosis מתואר כמי שהתפתח באופן קלונלי, ורוב הראיות שהצטברו במהלך השנים תומכות ברעיון שאירועי HGT ורקומבינציה מתמשכים לא יתרחשו ברמה הניתנת לגילוי של MTBC15,17,18.
עבודות קודמות הראו כי ייתכן שיש רקומבינציה מוגבלת בין זני MTBC20,21, בעוד שאחרות לא הצליחו לזהות אירועי רקומבינציה מדידים70,71. דון מחדש בנושא זה תוך התמקדות ב-Mycobacterium bovis, השונה מהעבודה הקודמת שבחנה רק את Mycobacterium tuberculosis70,71; או שקול את MTBC בכללותו, כמעט ללא M. bovis המייצג20; או שקול רק מקטעי בקר מגבילים. מערך הנתונים של מיקובקטריה, בעבודה זו, כולל סך של 70 זנים, המייצגים את כל הקומפלקסים המשובטים, המשמשים לסינון רקומבינציה. מערך הנתונים מחולק לפי ארבע רמות מצטברות: (1) חברי Eu2, (2) כל חברי קומפלקס המשובטים האירופי (כלומר אירופה), (3) קומפלקס המשובטים האירופי והאפריקאי (Eu + Af) ו-(4) כל אוספי הנתונים (כולל גנומים שאינם כלולים באף קומפלקס שיבוט שכבר תוארו).
כדי לחקור עוד יותר את ההשערה הזו, בוצעה רשת פירוק מפוצל כדי להעריך את היעדר אירועי רקומבינציה בין גנומים, מכיוון ששיטה זו יכולה לדמיין את הקשר הקדמון בין פרטים ולהציג אותות פילוגנטיים סותרים. כל ארבעת מערכי הנתונים בניתוח אישרו את קיומן של לולאות ברשת (כלומר, אזורים שאינם מתכנסים לעץ יחיד), אך למבחן Phi אין תמיכה סטטיסטית (Eu2, p = 0.0956; Europe, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; כל מערך הנתונים p = 0.2451), דבר המספק ראיות חלשות לקיומם של אירועי רה-ארגון (איור 3A-D).
באירופה 2 גנומים (n = 37) (א), גנומים אירופיים (n = 44) (ב), גנומים אירופיים ואפריקאים (n = 51) (ג) וכל מערך הנתונים (n = 70) (ד).
לאחר ניתוח זה, ובהתחשב בתצפיות המחזוריות בכל הרשתות, אלגוריתם השחזור שיושם בצינור Gubbins יושם כדי לשחזר את השושלת המשובטת ולהשלים את אומדן השפעת הרקומבינציה על הגנום של M. bovis. יש להסיק את המספר המצטבר של אירועי רקומבינציה, שרובם התרחשו בענפים סופניים (כלומר, בגנום יחיד) (טבלה 2). אינדיקטורים אלה מראים את העקביות של מערך הנתונים כולו ומצביעים על כך שתדירות אירועי הרקומבינציה היא פי 200 עד 300 מזו של המוטציות. לאחר שפרמטר ה-rho/theta המייצג את השיעורים היחסיים של רקומבינציה ומוטציות נקודתיות על הענף נראה בין 0.0037 ל-0.0056 (טבלה 3). לאחרונה, עבודה שפורסמה על זן 38 M. bovis הדגימה ערך rho/theta גבוה יותר (rho/theta = 0.1) מזה שהתקבל במערך נתונים זה, אך עבודתם של פטנה ועמיתיו השתמשה בהרכבה מבוססת ייחוס כדי להסיק פרמטרי רקומבינציה. פרט פרוצדורלי, עקב הליך ההרכבה, נקשר לשפע של אירועי רקומבינציה משוערים בענף הטרמינלי.
לאחר מכן, הפרמטר r/m מייצג את יחס הגיוון של רקומבינציה והכנסת מוטציות, וערכה הממוצע הוא בין 0.025 ל-0.037, דבר המצביע על כך שבהשוואה למוטציות, לרקומבינציה יש השפעה כוללת נמוכה יותר על הגיוון הגנטי של M. bovis (טבלה 3). לצורך השוואה מקיפה, נעשה שימוש בשיטה דומה כדי להעריך את פרמטר ה-r/m עבור מערך הנתונים MTBC המורכב מ-23 גנומים, המציג ערך ממוצע של 0.48620, בעוד שעבור מערך הנתונים של 38 M. bovis של פטנה ועמיתיו, הערך הממוצע הוא 0.98. במחקר הראשון, רק שניים מתוך 23 גנומים שנכללו בעבודת M. bovis (M. bovis BCG וזן הייחוס), כך שהערך המתקבל עשוי להיות מוטה עקב ביטוי יתר של גנום M. tuberculosis. בדוח השני, אוכלוסיות Mycobacterium bovis שנותחו נמצאו בעיקר מארצות הברית וממארחים של בעלי חיים. לעומת זאת, במערך הנתונים שלנו, מיוצגים יותר מיקומים גיאוגרפיים ומינים פונדקאים, וגנומים המקובצים לקומפלקסים שבטיים שונים בעלי מאפיינים גנטיים שונים באוכלוסייה משמשים גם הם, ובכך משיגים ידע עמוק ורחב יותר באוכלוסייה. ערך ההפרש הממוצע r/m שהתקבל עם מערך הנתונים שלנו עולה בקנה אחד עם התפיסה שמידת הרקומבינציה משתנה מאוד בין השושלות המשויכות לאותו מין טקסונומי, ולכן תוצאות אלו מצביעות על כך שקומפלקס השיבוט M. bovis עשוי להפגין הבדלים ברקומבינציה. ההשפעה היא גם כפי שהוצעה על ידי דידלוט ומיידן72. אף על פי כן, הרחבה משמעותית של מערך נתונים זה על ידי הכללת מספר גדול יותר של גנומים של M. bovis תאפשר הבהרה נוספת של נקודה זו. הן הפרמטרים r/m והן הפרמטרים rho/theta מראים שונות בין ענפים, ותוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים על מיני חיידקים אחרים72,73.
לבסוף, על מנת לאשר את אירועי הארגון מחדש שזוהו על ידי צינור Gubbins, שישה אלגוריתמים שונים שימשו בתוכנת RDP4 כדי לבחון באופן עצמאי השוואות ליבה מרובות שונות. באופן גלובלי, פחות ממחצית האירועים שזוהו על ידי Gubbins אושרו על ידי RDP4 (טבלאות 4 ו-5). בהתחשב בכל מערך הנתונים, אושרו שלושה אירועי רקומבינציה, שניים מעורבים צמתים פנימיים והשני מעורב גנום יחיד בענף סופי, שעבורו לא ניתן היה להקצות קומפלקסים שבטיים (טבלאות 4 ו-5). זיהוי אירועים בענפים סופיים עשוי להצביע על כך שהרקומבינציה עדיין מתבצעת בזני M. bovis עכשוויים או שהתוצאה שגויה70. באזור רקומבינציה היפותטי זה, לכ-20% מהמיקומים יש נוקלאוטידים לא מוגדרים (N), ובכך משפיעים על אות הרקומבינציה (איור משלים 2). בנוסף, אזור זה משפיע על הגן rrs, המקודד את ה-RNA הריבוזומלי 16S שצפוי להיות שמור מאוד, כך שאות רקומבינציה משוער זה עשוי להיות תוצאה של שגיאות ריצוף או חוסר יישור. לאחר מכן בוצע יישור הגנום כולו בין Mb0003 ל-Mycobacterium bovis AF2122/97, ואושר קיומם של נוקלאוטידים ו-SNPs לא מוגדרים, כך שהבעיות האפשריות הקשורות ליישור שגוי לא נבעו מהמידע הביולוגי שיושם בעבודה זו. הופיע לאחר למידת התוכנה.
לא נמצאו פערים או נוקלאוטידים לא מוגדרים באזורי הרקומבינציה של הצמתים הפנימיים (איורים 4 ו-5). בנוגע לאירועים אלה, אחד מכיל רק את הגנום Eu2 ומשפיע על הגן pks12, המקודד סינתאז פוליקטיד אפשרי; בעוד שהשני רשום בגנום Eu1 ומשפיע על הגן narX המקודד רדוקטאז ניטרט אפשרי (טבלה 4). באופן כללי, ניתוח הרקומבינציה מראה כי קיים מספר מוגבל של מקטעי רקומבינציה עם תמיכה סטטיסטית, והאינדיקטורים המשוערים מצביעים על כך שלרקומבינציה יש השפעה נמוכה על שושלת M. bovis. אות הרקומבינציה צפוי להיות נמוך, אך חשוב להבחין בין אות האבולוציה האמיתי לבין רעש הרקע, וזו משימה מאתגרת. על מנת להפחית את אות הרעש המופק על ידי בעיות הרכבה ואי-התאמה מבוססות ייחוס 70, 71, כל השאר, מלבד הגנום המלא, הורכבו מאפס, ואיכות ההרכבה נבדקה והובטחה על ידי ניתוח צינור QUAST (טבלה משלימה 1). בנוסף, בוצעה סדרה של ניתוחים משלימים כדי לספק את החוסן והדיוק של הסקר הכולל. לכן, איכות הריצוף של גנים narX ו-pks12 הוערכה על ידי מיפוי קריאות כנגד Mycobacterium bovis AF2122/97. מיקום ה-SNP המומלץ באזור הרקומבינציה אושר על ידי יישום הקריטריונים שהוזכרו בסעיף השיטה (לפחות 20 קריאות ותדירות שינוי של 0.9). הפולימורפיזם של גן narX אושר במלואו בשני הגנומים (Mb1792361 ו-Mb7240415; 2.3%) ובגנומים של גנום pks12: גנים Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 ו-Mb12. עם זאת, עבור הגנום Mb2043, שישה מתוך שמונה המיקומים אינם עומדים בקריטריון עומק הקריאה מכיוון שה-SNP נתמך על ידי מקסימום של 17 קריאות, הנמוך מערך הסף שנקבע של 20. לכן, ניתן לאשר את הרקומבינציה של שישה גנומים (8.6%) באתר גנום זה (איורים 4 ו-5).
הדמיה מפורטת של יישור אזור הרקומבינציה של מערך הנתונים Mycobacterium bovis משפיעה על הגן narX המקודד רדוקטאז ניטרט אפשרי. לא נמצאו פערים או נוקלאוטידים לא מוגדרים באזור הרקומבינציה של הצמתים הפנימיים. אירוע מסוים זה נרשם בגנום Eu1. איכות הריצוף של הגן narX הוערכה על ידי רישום הקריאות של Mycobacterium bovis AF2122/97. אשר את מיקום ה-SNP המומלץ באזור הרקומבינציה על ידי יישום הקריטריונים המוזכרים בסעיף השיטה (לפחות 20 קריאות ותדירות שינוי של 0.9%). הפולימורפיזם של הגן narX אושר במלואו בגנומים של Mb1792361 ו-Mb7240415 (2.3%).
ויזואליזציה מפורטת של יישור אזור הרקומבינציה של מערך הנתונים Mycoplasma bovis המשפיע על הגן pks12. לא נמצאו פערים או נוקלאוטידים לא מוגדרים באזור הרקומבינציה של הצמתים הפנימיים. בנוגע לאירוע המשפיע על הגן pks12 המקודד סינתאז פוליקטיד אפשרי, הוא מכיל רק את הגנום Eu2. איכות הריצוף של pks12 הוערכה על ידי מיפוי קריאות של Mycobacterium bovis AF2122/97. אשר את מיקום ה-SNP המומלץ באזור הרקומבינציה על ידי יישום הקריטריונים המוזכרים בסעיף השיטה (לפחות 20 קריאות ותדירות שינוי של 0.9). הפולימורפיזמים של הגנומים Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 ו-Mb1960 אושרו במלואם.
לגנים של PE ו-PPE יש אזורים חוזרים אשר נקראים בקלות באופן שגוי על ידי ריצוף ומיפוי שגוי של Illumina, ולכן הם בדרך כלל נמחקים מתהליך העבודה הביואינפורמטית של חברי M. tuberculosis רק בעת שימוש באסטרטגיית מיפוי-לרצף. ההסקה של אירועי רקומבינציה המיושמת בעבודה זו מבוססת על הרכבה de novo ללא סינון PE/PPE. אנו מאמינים שעל ידי יישום שלוש שיטות ואלגוריתמים משלימים שונים באמצעות תוכנת SplitsTree, Gubbins pipeline ותוכנת RDP4, האסטרטגיות המיושמות חזקות לעיבוד וסינון אזורים מאורגנים מחדש הנגרמים על ידי אותות שגיאה. עם זאת, על מנת לשלול את ההפרעה של הגן PE/PPE בתוכנת Gubbins ו-RDP4 לזיהוי אשכולות SNP, ולכן את זיהוי אזורי הרקומבינציה שהוצעו להשפיע על הגנים narX ו-pks12, נבדקה שכנותם של גנים אלה (איור משלים 3-5). ב-M. bovis AF2122/97, הגן narX מופרד על ידי narK2 ו-Mb1764c, בעוד ש-pks12 מוקף על ידי Mb2075c ו-Mb2073c (איור משלים 3-5). המפה שנוצרה באמצעות מפת הסינליין MAUVE של הגנום המלא מספקת מידע על שימור רצף הגנים וסידור מחדש, ומציגה ארבעה בלוקים קולינאריים, וללא סימנים של טרנסלוקציה או היפוך גנום. בנוסף, ניתוח ההשלמה עם רצף חומצות האמינו הוכיח את ההומולוגיה בכל הגנומים המלאים, ולא נמצאה PE/PPE באזורים הסמוכים של narX או pks12. עבור narX, לגנום אחד (Mb0030) יש ציון סינרונימי נמוך יותר מכיוון שגן narX זוהה כשני מקטעים (מקטעים 1891 ו-1890). עבור pks12, עקב קווי דמיון, Mb0030 ו-Mb003 הציגו ציוני סינלינאריות נמוכים יותר, בעוד ש-pks12 זוהה בשניים ושלושה מקטעים, בהתאמה, המייצגים דומיינים שונים של החלבון (איור משלים 3-5). בהתחשב במידע זה, ובביצוע ניתוח של תוכנות Gubbins ו-RDP4, בודק את יישור הליבה המרובה של 500 בסיסים מקסימליים בחלון, אישרנו שגן PE/PPE לא יפריע לאות הרקומבינציה המשפיע על narX ו-pks12.
למרות שאותות הרקומבינציה שזוהו במערך נתונים זה עשויים להיחשב כשיוריים, נכון שלא ניתן לשלול רקומבינציה ב-M. bovis, ולכן יש להמשיך ולבחון אותה בהמשך, שבו גנומים שלמים מתרחישים אפידמיולוגיים שונים מרוצפו לדרגת חשיבות.
השוואת עצי הפילוגנטיקה של ML שהתקבלו לפני ואחרי תיקון רקומבינציה (איור 2א', ב') לא הובילה לשינויים משמעותיים בקשר הפילוגנטי המשוער, וזני M. bovis אוגדו באותה קבוצה.
לאחר מיפוי 42 קריאות M. bovis שרוצפו לאחרונה עם גנום הייחוס של M. bovis AF2122/97, התקבל יישור SNP המכיל 1816 עמדות פולימורפיות. רוב ה-SNPs (87.1%) ממוקמים באזור הקידוד, והגנים המושפעים מאופיינים לפי הקטגוריות התפקודיות המוצגות ב-Bovilist (איור 6A, B). בהתחשב במספר הכולל של גנים בכל קטגוריה תפקודית, הגנים בקטגוריית "מטבוליזם שומנים" הראו יותר SNPs, ואחריהם "דופן התא ותהליכי התא" ו"מטבוליזם ביניים ונשימה", מה שחושף שהם נמצאים באבולוציה של M. bovis.
ניתוח היררכי של מערך הנתונים של M. bovis מפורטוגל (n = 42). המספר הכולל של SNPs רשומים וגנים מושפעים עבור כל קטגוריה תפקודית (A). המספר הכולל של שינויים נרדפים ולא נרדפים שנרשמו לפי קטגוריית תפקוד (B).
בקנה מידה עולמי, יחס dN/dS הממוצע טוב מ-1.5, דבר המצביע על כך שהלחץ האבולוציוני העולמי הוא להיפטר מהמצב האבותי ומייצג תרחיש בחירת טיהור חיובי (מגוון או מכוון) ו/או רגוע. בקטגוריות של "ארסיות, ניקוי רעלים, אדפטציה", "רצפי החדרה ופאג'ים" ו"חלבונים רגולטוריים", יותר משני שלישים מה-SNPs אינם נרדפים (איור 6B).
בכל הקטגוריות, ישנם גנים עם מספר SNPs, מה שמביא לשיעור מוטציה ממוצע (כלומר, ה-SNP הממוצע לכל גן) גדול מ-1 (איור 6A). ל-Pks12 (Mb2074c) עם 15 SNPs ול-fas (Mb2553c) עם 8 SNPs יש ערכי מוטציה גבוהים יותר. שני הגנים הללו מעורבים במטבוליזם של חומצות שומן. הגן pks מקודד לפוליקטיד סינתאז (PKS), שהוא אנזים רב תכליתי המעורב בביוסינתזה של ליפידים בדופן התא של חיידקי מיקובקטריאליים74,75. גן זה מקודד לפוליפפטיד רב תכליתי המעורב בסינתזה של מיקוקטידים74,76. הגן fas מעורב בסינתזה של חומצה מיקולית. שני הגנים הללו ממלאים תפקיד חשוב בביוסינתזה של דופן התא במגע עם המארח.
על מנת לחקור עוד יותר את האבולוציה של Mycobacterium bovis, נותחו שתי קבוצות של גנים ספציפיים. עבודות שפורסמו בעבר תוך שימוש בשיטות הרכב רצפים ושיטות פילוגנטיות זיהו גנים שנרכשו על ידי אבות MTBC באמצעות HGT לפני גיוון37,38. גנים אלה מופיעים בטבלה המשלימה 2. נותחה התפלגות ה-SNP של סך של 77 גנים שעשויים להיות קשורים ל-HGT, וזוהו 26 אתרים פולימורפיים, שברוב המקרים (78%) הביאו לשינויים לא-סונימיים (NS) (טבלה משלימה 2). עבודה קודמת על גנום MTBC הראתה כי אזור ה-HGT המשוער מציג יחס SNP NS גבוה יותר בהשוואה לשאר הגנום. אם חושבים שאזורי רקומבינציה אלה נרכשו על ידי אבות MTBC, ולכן הם מייצגים יתר על המידה פולימורפיזמים קדומים, אזי צפוי ששיעור השינויים הסונימיים יהיה גבוה יותר, מכיוון שצפויים שהחלפות NS יבוטלו על ידי סלקציה שלילית בגלל שינויים בחומצות אמינו שעשויים לשנות את תפקוד החלבון. לכן, תוצאותינו מצביעות על כך שההשלכות התפקודיות עשויות לנבוע מהחלפת גנים דמויי HGT, דבר המשקף את חשיבותם לגיוון גנטי אדפטיבי בעל ערך.
במקביל לניתוח זה, נבדקו ביסודיות הגנים המקודדים את רכיבי מערכת ה-3R (תיקון, שכפול ורקומבינציה של DNA) בהתאם לרשימה שפורסמה בעבר על ידי דוס וולטוס ועמיתיו (2008)39. לא ניתן לצפות ישירות בחילופי מקטעי DNA זהים, אם כי ייתכן שזהו תהליך שכיח כאשר מעורבים חיידקים קרובים זה לזה, כמו במקרה של מערך נתונים זה; בנוסף, תהליך זה עשוי להיות המפתח לשיטות תיקון DNA72, ולכן הם ממלאים תפקיד ברקומבינציה הומולוגית. סך של 26 עמדות פולימורפיות המחולקות על ידי 54 גנים זוהו (טבלה משלימה 3). בקבוצת גנים זו, שינויים ב-NS היוו כ-65% מההשלכות, דבר התואם דיווחים קודמים על זני Mycobacterium tuberculosis.