Natureをご訪問いただきありがとうございます。ご利用のブラウザバージョンでは、CSSのサポートが制限されています。最適なエクスペリエンスを得るには、ブラウザの最新バージョンをご利用いただくか、Internet Explorerの互換モードをオフにすることをお勧めします。また、継続的なサポートを確保するため、当サイトではスタイルシートとJavaScriptを無効にしてサイトを表示しています。
ゲノム配列決定は感染症研究分野を活性化させ、疾患の疫学、病原性、宿主-病原体相互作用、および病原体に課せられた進化のプロセスを明らかにしました。Mycobacterium tuberculosis複合体（MTBC）では、Mycobacterium bovisを陸生哺乳類に結核（TB）を引き起こす動物適応メンバーの1つと見なし、細菌の進化の典型的なモデルです。他のMTBCメンバーと同様に、Mycobacterium bovisは厳密にクローン化された、ゆっくりと進化する病原体であると考えられており、明らかに組換えや水平遺伝子伝播の兆候はありません。本研究では、異なる血統（ヨーロッパとアフリカ）の70頭の牛M.で構成された全ゲノム配列（WGS）データセットに比較ゲノミクスを適用し、牛M.の遺伝的多様性についての洞察を得ます。進化の力。再編成の兆候を推定するために、3つの異なる方法が使用されています。世界的に、少数の組み換え事象が2つの独立した方法によって確固たる裏付けのもとに特定・確認されている。しかしながら、突然変異と比較すると、組み換えがM. bovisの多様性に与える影響は弱い（全体のr/m = 0.037）。本データセットにおけるMycobacterium bovisのクローン複合体で得られたr/m平均値の差は、同じ分類学上の種に分類される系統間でも組み換えの程度が大きく異なる可能性があるという一般的な概念と一致している。本研究に基づくと、Mycobacterium bovisにおける組み換えは否定できないため、世界中の様々な疫学的シナリオから得られた大規模データセットのWGSが不可欠となる今後の比較ゲノミクス研究において、更なる研究の対象となるべきである。その後、多宿主結核の蔓延から得られた、より小規模なMycobacterium bovisデータセット（n = 42）を対象に追加解析を実施したところ、1,800以上の遺伝子座が同定され、そのうち少なくとも1つの株で一塩基多型（SNP）が認められました。そのほとんど（87.1%）はコード領域に位置し、同義変化に対する非同義変化の全体比（dN/dS）は1.5を超えており、正の選択がMycobacterium bovisに及ぼす重要な進化的力であることが示唆されています。「脂質代謝」、「細胞壁および細胞プロセス」、「中間代謝および呼吸」といった機能カテゴリーに富む遺伝子では、より高い割合のSNPが検出され、Mycobacterium bovisの生物学および進化におけるそれらの重要性が明らかになりました。水平遺伝子伝播を起こしやすく、3R（DNA修復、複製、組み換え）システムに含まれるMTBC祖先の遺伝子を詳しく見ると、タイジマのD中立テストのグローバル平均陰性値が明らかになり、過去の選択的スキャンを示しています。個体数増加後の最近のボトルネックは、必須病原体であるMycobacterium bovisが宿主と戦うための主な進化的推進要因であり続けています。
結核菌複合体（MTBC）は、細菌性病原体の中でも最も成功した分類群の一つであり、細菌の進化の典型例です。その構成菌は、ゲノムレベルで驚くほど高いヌクレオチド相同性（99%以上）を示します1,2。MTBCの異なるエコタイプは、小型哺乳類からヒトまで、幅広い宿主種において、感染性肉芽腫性疾患である結核（TB）を引き起こす可能性があります3,4,5。現在、この複合体には、ヒト（結核菌（Mtb）、Mycobacterium africanum）と、動物に適応した病原体（Mycobacterium bovis、Mycobacterium capitum、Mycobacterium pinnipedum、Mycobacterium microtobacter、Mycobacterium mongee、Mycobacterium miysani、Mycobacterium surika、Bacillus chimpanzee、Bassie）が含まれます5,6。 M. canettii (別名「Nodobacter glabrata」) 前述の結核菌との平均ヌクレオチド同一性は 98% であり、比較ゲノム研究により、M. canettii とその他の MTBC は共通祖先から最近分岐したことが明らかになっています。7 この概念を考慮して、一部の著者は M. canettii を MTBC のメンバーと呼んでいます 8。
MTBC は系統的に厳密なクローン複合体として説明されており、その集団構造は多様性の低下、ボトルネック、選択的スキャン、および遺伝的浮動によって明確に支配されています9,10。 欠損した多型などの複雑な厳密なクローン進化を想定すると、組み換えによって修復することはできません。 この前提に基づいて、差異領域 (RD) のゲノム欠失と TbD1 (Mtb 特異的欠失 1 領域) の連続イベントが MTBC 進化の分子マーカーとして提案されています2,5,11。 比較ゲノミクスと全ゲノム配列決定 (WGS) 作業により、ヒトに適応したメンバーが 9 つの系統 (Mycobacterium tuberculosis L1 から L4、L7、および L8、および Mycobacterium africanum L5、L6、および L9) に分類され、系統 L2 から L4 は TbD1 領域を共有して欠失しています2,11,12,13。さらに、動物に適応したメンバーは共通の祖先を共有することが提案されており、これは RD7、RD8、RD9、および RD102、5、および 14 の系統特異的な欠失によって定義されます。
水平遺伝子伝播（HGT）と組み換え現象は稀であると考えられており、MTBC全体の異なる歴史ではなく、MTBCの祖先に発生すると考えられています15,16,17。Hughesら（2002年）およびGutackerら（2006年）による初期の2つの報告では、組み換え現象がM. tuberculosis株の特定の遺伝子座を特徴付ける多型の形成に寄与する可能性があることが示唆されています18,19。MTBCで組み換えが明らかに起こらない理由は、(1) HGTの機械的プロセスと能力の喪失、(2) HGT現象の稀少性、(3) MTBCニッチにおいて組み換え現象が発生する可能性が全くないこと14,17です。最近、MTBC 株 20 と Mycobacterium bovis 21 に適用されたいくつかの全ゲノム配列解析 (WGS) 研究により、組み換えの証拠が示され、MTBC 株は小さな DNA 断片を頻繁に交換するが、ヌクレオチド配列の変異が限られているため、これらのイベントはまだ注目されていないことが初めて示されました。
Mycobacterium bovisは、家畜（主に牛）から最も多く検出されるMTBC菌ですが、放し飼いや柵で囲われた野生動物からも分離されることがあります4,22,23,24。M. bovisは、スポリゴタイピングプロファイル、特定の遺伝子における特定の欠失および一塩基多型（SNP）25, 26, 27, 28, 29に基づき、5つの主要なクローン複合体（ヨーロッパ型1（Eu1）、ヨーロッパ型2（Eu2）、ヨーロッパ型3（Eu3）、アフリカ型1（Af1）、アフリカ型2（Af2））に進化しました。これらのクローン複合体は、Mycobacterium bovis個体群の多様な構造と、その地理的地域との関連性を示しています。さらに、Zimpelら（2020）による最近のWGS研究では、1,900以上のゲノムを持つMycobacterium bovisのSNPに基づく系統樹が設計され、少なくとも4つの異なる系統（Lb1からLb4と命名）が存在することが示唆されました。これらの系統は、以前に定義されたクローン複合体とは完全には一致していませんが、地理的特異性も確認されています30。これらの著者は、系統樹の差異解析と分子年代測定を行いましたが、組換えについては研究していません30。
スポリゴタイピング、MIRU-VNTR（Mycobacterium bovisの散在反復単位-可変タンデム反復数）、そして最近のSNPタイピングといった様々な分子生物学的手法を用いたこれまでの研究により、M. bovisの株間には一定レベルの遺伝的多様性があることが明らかになっています31,32,33, 34,35。遺伝的変異の分化は、疾患疫学研究において重要なツールとなっており、病原性、毒性、そして疾患伝播の詳細な理解に役立ちます。WGS法の登場により、Mycobacterium bovisのゲノムが様々な宿主や疫学的シナリオに適応し、生存し続ける過程において、その進化の駆動要因を解明する可能性が開かれました。
本研究では、異なるクローン複合体からの分離株を含むさまざまな Mycoplasma bovis データセット (n=70) の比較ゲノム解析を使用して、Mycoplasma bovis の進化プロセス、特に系統関係と組み換えイベントを解明する洞察を得ます。この分析の補足として、ポルトガルの十分に特徴付けられた多宿主結核地域 31,36 から得られた M. bovis 分離株 (n = 42) のサブデータセットをさらに調査し、非同一性を推測しました。センス (dN) ヌクレオチド置換と同義 (dS) ヌクレオチド置換の相対比率のバランス、および文献に記載されている特定のゲノムの進化的寄与は、MTBC の祖先が HGT を通じて獲得し、3R (DNA 修復、複製、および組み換え) システム遺伝子コンポーネント 39 をコードしていることから明らかです。HGT を通じて獲得した遺伝子は古代の多型を表す可能性があるため、これらの遺伝子を選択すると、同義変化の割合が高くなることが予想されます。 3Rシステムに含まれる遺伝子は、M. tuberculosis株に関するこれまでの研究で、これらの遺伝子に作用する一般的なネガティブ／精製選択が示されており、進化において重要な役割を果たす可能性があることから選択されました39。本研究のもう一つの目的は、再編成イベントの存在を推測することです。このため、ポルトガルのデータセットには、ヨーロッパクローン複合体2と、クローン複合体に割り当てられていない株のゲノムのみが含まれていることを考慮し、最終的にすべてのクローン複合体の代表値を得るために、公開されているゲノムデータを含めることにしました。これにより、結果の堅牢性と幅が広がりました。
ポルトガルの風土病性多宿主結核現場から新たに配列決定された 42 の Mycoplasma bovis ゲノム (詳細は下記) が、以前に疫学的観点から特徴付けられており 36、本研究の中心となっています。ポルトガルのデータ セットには、ヨーロッパ 2 クローン コンプレックスの代表と、指定コンプレックスのない株のみが含まれていることを考慮して、公開されている全ゲノム配列決定データを追加し、M. bovis クローン コンプレックスの代表をすべて含むデータ セットを拡張しました。したがって、本研究では 3 つの全ゲノム配列決定データ ソースを使用しました。完全/ドラフト ゲノム アセンブリ、NCBI (国立生物工学情報センター) に保存されている最大 10 のスキャフォールド (n = 15 分離株)、SRA (シーケンス読み取りアーカイブの Illumina fastq ファイル) に保存されている M. bovis クローンの複雑な多様性 (n = 12 分離株)30およびポルトガルから新たに配列決定された42のゲノム。Mycobacterium bovis BCG（Bacille Calmette-Guerin）はNCBI検索から除外されました。M. bovis AF2122/97は通常、データセットに含める参照ゲノムとして使用されます。African 1クローニング複合体によって表される全ゲノム配列が公開されておらず、Af2およびEu1の代表株のゲノム数が少ないため、これらのケースではSRAによって提供された元の配列データが使用されました。Zimpelと彼の協力者（2020）の研究は、前述のクローニング複合体からのゲノムを識別し、データセットに含めるMycobacterium bovisを選択するのに役立ちました。Eu3については、1種類のゲノムのみが記載されています（Branger et al.、2020）。そのため、ここに含めるゲノムは、Eu3複合体の別の代表です。
このデータセットには、1985年から2016年にかけて12カ国に分布し、8種の宿主種から分離されたウシM. bovis 70株が含まれています。36種はEu2、7種はEu1、1種はEu3、3種はAf1、4種はAf2と分類され、19種はどのクローン複合体にも属さないものでした（詳細は下記参照）。本研究で使用したMycobacterium bovisの詳細情報（アクセッション番号を含む）は、表1および補足表1に示されています。
ポルトガルの動物結核ホットスポットから採取され、12年以上分布しているMycobacterium bovisの全ゲノム42個が新たに配列決定され、この研究の中心となっています。これは、潜在的な野生動物と家畜の病気のシステムが定期的に監視されているためです31,36（補足図1）。その後の手順に従って、これらの株は2003年から2015年の間にウシ（n = 14）、アカシカ（n = 16）、イノシシ（n = 12）から分離されました。推奨されるプロトコルガイドラインに従って動物を収集および取り扱います。組織サンプルはOIE陸生動物ハンドブックにあり、StonebrinkおよびLöwenstein-Jensenピルビン酸固体培地および液体培地に接種されます。培養物は37°Cでインキュベートし、少なくとも12週間、週に1回増殖を確認します。コロニーは-80ºCのグリセロール溶液に直接保存されます。 Mycobacterium 選択培地 (Middlebrook 7H9、BD Diagnostics) で、元のアーカイブサンプルを in vitro で 1 回の継代培養し、WGS プログラムの DNA を取得しました。このため、凍結培養ストック溶液に、Middlebrook 7H9 で 37°C で 5% ピルビン酸ナトリウムと 10% ADS (1 L の水に 50 g アルブミン、20 g グルコース、8.5 g 塩化ナトリウム) を添加して強化しました。4 週間の増殖後、培地を交換し、増殖が観察されるまで定期的に培養をモニタリングしました。細胞を遠心分離で回収し、ペレットを 500 µL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に再懸濁し、99 °C で 30 分間加熱した後、遠心分離し、上清を WGS まで -20 °C で保存しました。すべての手順は、レベル 3 バイオ セーフティ施設で実施しています。
WGSペアエンドゲノムライブラリは、各DNAサンプルの固有インデックスを用いて調製され、Illumina MiSeq（2×250 pb）（40サンプル）およびHiSeq（2×150 pb）（2つの分離株）技術（Eurofins Genomics、ドイツ）を用いてシーケンシングされます。メーカーの指示に従い、ダブルエンドモジュールアタッチメントを装着したIllumina Genome Analyzerを用いてゲノムDNAをシーケンシングし、IlluminaのNextera XT DNA Library Prep Kitを用いてライブラリを構築します。
SRA（n = 12）から回収されたデータを考慮すると、クローン複合体の同定は、対応する出版物30、41、43のメタデータとして使用できる。完全ゲノムを考慮すると、それぞれEu1およびEu3クローン複合体25、29のメンバーとして認識されているMycobacterium bovis AF2122/97およびMycobacterium bovis 3601を除き、Mycobacterium tuberculosis H37Rv（NCBIアクセッション番号NC_000962.3）の完全ゲノムと同じである。ゲノムアライメントは、MAFFT（アミノ酸またはヌクレオチド配列の多重アライメントプログラム、バージョン7.458）およびパラメータ-addfragments48を使用して実行される。次に、異なるクローン複合体の欠如および/またはSNP特性の存在を検索する。
新たに配列決定されたMycobacterium bovis（n = 42）とアセンブルされたゲノムドラフトの元のリード（n = 3）は、vSNPパイプラインと異なるクローンの欠失および/またはSNP機能の存在を通じて、複合体を参照ゲノムMycobacterium tuberculosis H37Rvと整合させて検索されました。
特徴の欠如、SNPの有無、およびスポリゴタイピングプロファイルから情報を収集し、ゲノムデータを対応するクローン複合体に割り当てます。4つのドラフトアセンブリについては、スポリゴタイピングプロファイルを推測できないため、「複雑性なし」グループに含めます。
本研究で採用したバイオインフォマティクスワークフローは、de novoアセンブリとリファレンス戦略へのマッピングから始まり、組換えイベントと特定のゲノム多型の探索を目的としています。図1は、その手順のフローチャートを示しています。組換え解析では、推論および関連指標の堅牢性を高めるために、すべてのゲノムが用いられます。
ゲノムコンセンサス配列生成におけるエラーを低減するため、まずde novoアセンブリを取得し、次にコアマルチプルアライメントを取得しました。Unicyclerパイプラインは現在https://github.com/rrwick/Unicycler49で公開されており、54個のシーケンス済みゲノム（新規シーケンス済み42個とSRAから復元したfastqファイル12個）のde novoアセンブリを実行するために使用されています。つまり、最初からアセンブルする前に、FastQCバージョン0.11.7（https://github.com/s-andrews/FastQC）とTrimmomaticバージョン0.36（「リードからアダプターやその他の照明固有の配列をカットする」および「リードの末端から塩基をカットし、品質閾値20を下回る場合」オプションを適用）（http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic）50でリード品質解析を実施しました。その後、ゲノムアセンブルにはSPAdes optimiser49を使用し、アセンブル後の最適化にはPilonバージョン1.1851を使用しました。誤ったアセンブルを回避するために保守的なブリッジングモードを選択し、k-merサイズはリード長の20%から95%の間で検索・選択しました。 SPAdes ガイドラインに従い、読み取りサイズを考慮し、300 bp 未満のコンティグを削除し、20 読み取り深度のカバレッジ カットオフを 52 に設定します。de novo アセンブリ戦略では、高度に反復的なプロリン-グルタミン酸 (PE) およびプロリン-プロリン グルタミン酸 (PPE) パラログなどのゲノム領域は削除されませんでした。
de novo アセンブリの品質は、コンティグの更新と M. bovis AF2122/97 参照ゲノム (NCBI アクセッション番号 LT708304.1) マッピングを容易にする QUAST パイプライン (http://quast.sourceforge.net/quast.html) を通じて評価されます (品質パラメータについては補足表 1 を参照)。
vSNPパイプライン（https://github.com/USDA-VS/vSNP）を用いて、イルミナシーケンシングから新たにシーケンスされたM. bovisのFASTQファイルを、M. bovis AF2122/97リファレンスゲノム（LT708304.1）と比較した。ゲノム解析ツールキット（GATK）53, 54, 55のベストプラクティス推奨事項に従って、標準フィルターパラメーターまたは変異質量スコアを再較正用に適用した。結果は、SAMtoolsの最低質量スコア150およびAC = 2を使用してフィルタリングされた。また、Kraken（http://ccb.jhu.edu/software/kraken/）を使用して読み取り値を確認し、汚染を除外した。本研究でシーケンス戦略にマッピングするために使用されるvSNPパイプラインは、定義された一連のSNPとターゲットを検査し、混合感染シナリオも除外する。読み取りゲノムカバレッジは 99% を超えています (補足表 1)。
マッピングエラーと間違った SNP を回避するには、次の場合にバリアントを除外します。(1) 20 未満の読み取りでサポートされている、(2) 0.9 未満の頻度で発見されている、(3) 少なくとも 1 つの株に存在するが、別の株には少なくともギャップがある。統合ゲノミクス ビューアー (IGV) バージョン 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 を使用して、マッピングまたはアライメントの問題がある SNP と位置を視覚的に検証しました。プロリングルタミン酸 (PE) 遺伝子とプロリンプロリングルタミン酸 (PPE) 遺伝子は重複度が高く、複数遺伝子ファミリーの一部であるため、イルミナのシーケンスによって誤解されやすく、マッピングミスが発生する可能性があるため、結核菌バイオインフォマティクス ワークフローでは、シーケンスにマッピングして SNP を確認する戦略を使用する際に、結核複合体のメンバーを除外しました。したがって、PE/PPE 遺伝子とインデルを分析から除外しました。
Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) によれば、すべてのSNPは機能カテゴリーに分類されます。SNPの影響（同義変化または非同義変化）を推測するために、SnpEffパイプライン (https://pcingola.github.io/SnpEff/) が使用されています。Mycobacterium bovis AF2122/97ゲノム (LT708304.1) の新しいデータベースを作成しました。
コアゲノムのマルチプルアライメントは、現在https://github.com/marbl/parsnp57で入手可能なParsnp v1.2を用いて、69個の完全ゲノム／ドラフトアセンブリ（オプション-cを使用）を用いて実施しました。M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) を参照として用いました。コアマルチプルアライメントは4つ実施しました。Eu2クローニング複合体のメンバーのみ（n = 37）、ヨーロッパクローニング複合体の全メンバーを含む（n = 44）、ヨーロッパクローニング複合体とアフリカクローニング複合体の接合点を含む（n = 51）、そして本研究で使用した全てのMycobacterium bovisを含む（n = 70）。
Parsnp によって生成されたコアアラインメントは、RAxML を使用して CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 で最大尤度 (ML) 系統樹を推定し、1000 回のガイド付きレプリケーションを実行するために使用されます。
組み換えイベントの存在を並行して確認するために、SplitsTree4 ソフトウェア、Gubbins (ヌクレオチド配列の組み換えによる偏りのない系統) パイプライン、および RDP4 (組み換え検出プログラム、バージョン ベータ 4.101) ソフトウェアの 3 つの異なるアルゴリズムとバイオインフォマティクス ツールが使用されます。
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 に実装されている分割分解法を用いて根なし系統ネットワークを計算し、統計的検証にはPhi検定を用い、有意水準はp = 0.05とした。Parsnpのコアマルチアライメント解析を入力として用い、ネットワーク標準としての分割分解を実現した。
Gubbins パイプライン v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) は、Mycobacterium bovis への組み換えの影響を評価する別の方法として、デフォルトのパラメーターで実行されます。パイプラインに実装されているアルゴリズムは、関連するクローン系統を再構築します。データセットの完全なゲノム/ドラフトアセンブリと参照ゲノム (ウシのウシ科動物 AF2122/97、LT708304.1) は相互に、ツリーの各ブランチ上の SNP の位置をスキャンして、組み換えイベントを表す SNP クラスターを検出します。ブランチのゼロでは、組み換えイベントがないと仮定します。つまり、ブランチで発生する SNP は均等に分散されている必要があります。Parsnp からのコアマルチプルアライメントと RAxML からの最高スコアの ML ツリーが入力ファイルとして使用されます。
最後に、Gubbinsパイプラインによって示唆された再編成イベントを確認するために、RDP467に実装されている6つのアルゴリズム（RDP61、GENECONV62、Bootscan63、Maxchi64、Chimaera65、SiScan66）を、デフォルト設定でParsnpのコアマルチプルアライメントに適用しました。RDP4に実装されているアルゴリズムのうち少なくとも3つは、各組換えイベントを検証するために重要なシグナルを一貫して示す必要があると判断しました。
GubbinsソフトウェアとRDPソフトウェアはどちらも、最大500 bpのウィンドウ内でコアマルチアライメントをチェックすることで組換えシグナルを探し、de novoアセンブリ中にPE/PPE遺伝子が含まれていても、検出された組換えシグナルに影響を与えないことを確認していることから、組換えイベントを特定する遺伝子の近傍をホモリニアリティチェックによってさらに解析します。全ゲノムを用いたシンリニアリティマップは、MAUVEマルチゲノムアライメント（http://darlinglab.org/mauve/mauve.html）を用いて構築し、局所的なゲノム転座や逆位を除外しました。さらに、全ゲノムを用いて、SyntTaxウェブサーバー（https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/）を介してアミノ酸配列のホモリニアリティ解析を実施しました。
ポルトガルの多宿主結核システムから得られたゲノムデータセットのより詳細な解析は、文献に記載されている遺伝子の多型性を確認することである。これらの遺伝子は37、38、およびMTBCの祖先がHGT（DNA修復、複製、および組換え）システム構成要素39を介して獲得した3Rをコードする遺伝子である。ClustalX v2.1（http://www.clustal.org/clustal2/）とDnaSP v6.12.03（http://www.ub.edu/dnasp/）を用いて、遺伝子多様性とヌクレオチド多様性（π）およびTajimaのD中立検定パラメータ入力を計算した。
69 の Mycoplasma bovis 分離株と参照ゲノムに基づく最大尤度 (ML) 系統樹が得られました (図 2A)。単一遺伝子ベースの樹木や複数遺伝子座ベースの樹木と比較して、この戦略により、ゲノム全体の変動を捉えず、したがって種間の識別能力が低い 68,69 を示す、より強力な樹木の生成が可能になります。ML 樹木の位相構造は、通常、クローンの複雑な分類と一致しています。Eu2 のゲノムは枝にクラスター化されており、Af1 のゲノムも一緒にクラスター化されています (図 2A)。この結果は、Mycobacterium bovis の既知の進化関係とも一致しています。つまり、Eu1 メンバーと、他のすべてのクローン複合体とゲノムからなるグループとの間には大きな違いがありますが、クローン複合体 30 は指定されていません。クローン複合体と系統樹で観察される関係との間のわずかな矛盾は、クローン複合体が特定のゲノム領域に基づいて記述されるのに対し、系統樹はゲノム全体を表すコアゲノムの複数のアラインメントに基づいているという事実によって説明できます。
ウシ型結核菌ゲノムのコアゲノムアライメントに基づき、組換え部位除去前（A）と除去後（B）のゲノム配列に基づいて最尤系統樹（GTR）を構築した。枝の色はウシ型結核菌クローン複合体を表し、ヨーロッパ1は紫、ヨーロッパ2は赤、ヨーロッパ3は青、アフリカ1はオレンジ、アフリカ2は緑である。系統樹は根付き、縮尺通りに描かれており、枝の長さは各部位の置換として測定されている。
Mycobacterium tuberculosis 複合体はクローン進化するものとして説明されており、長年にわたって蓄積された証拠のほとんどは、進行中の HGT および組み換えイベントは MTBC の検出レベルでは発生しないという考えを支持しています15,17,18。
これまでの研究では、MTBC 株間では限定的な組み換えがある可能性があることが示されていますが20,21、他の研究では測定可能な組み換えイベントを特定できませんでした70,71。Mycobacterium bovis に焦点を当ててこの問題を再検討してください。これは、Mycobacterium tuberculosis 70,71 のみを考慮したこれまでの研究とは異なります。または、M. bovis がほとんど含まれない 20 MTBC 全体を考慮してください。または、制限的な牛の分画のみを考慮してください。この研究の結核菌データセットには、組み換えのスクリーニングに使用されるすべてのクローン複合体を代表する合計 70 株があります。データセットは、4 つの累積レベルに従ってスケーリングされています。(1) Eu2 メンバー、(2) すべてのヨーロッパクローン複合体メンバー (つまり、ヨーロッパ)、(3) ヨーロッパとアフリカのクローン複合体 (Eu + Af)、および (4) データコレクション全体 (すでに説明したどのクローニング複合体にも含まれていないゲノムを含む)。
この仮説をさらに検証するため、ゲノム間の組み換えイベントの有無を評価するために、分割分解ネットワークを実施した。この手法は、個体間の祖先関係を可視化し、相反する系統発生シグナルを表示できるためである。解析に使用した4つのデータセットすべてにおいて、ネットワーク内にループ（つまり、単一のツリーに収束しない領域）が存在することが確認されたが、ファイ検定では統計的裏付けが得られなかった（Eu2、p = 0.0956、ヨーロッパ、p = 0.1637、Eu + Af、p = 0.2774、データセット全体、p = 0.2451）。これは、再編成イベントの存在を裏付ける証拠としては不十分である（図3A-D）。
ヨーロッパ2ゲノム（n = 37）（A）、ヨーロッパのゲノム（n = 44）（B）、ヨーロッパとアフリカのゲノム（n = 51）（C）、およびデータセット全体（n = 70）（D）。
この分析の後、すべてのネットワークにおける周期的な観測を考慮し、Gubbinsパイプラインに実装された再構築アルゴリズムを適用してクローン系統を再構築し、M. bovisゲノムにおける組換えの影響の推定を補完しました。組換えイベントの累積数を推定すると、そのほとんどは末端分岐（つまり、単一のゲノム内）で発生していました（表2）。これらの指標はデータセット全体の一貫性を示しており、組換えイベントの頻度は突然変異の200～300倍であることを示しています。分岐における組換えと点突然変異の相対速度を表すrho/thetaパラメータは、0.0037～0.0056の範囲にあるようです（表3）。最近、38 の M. bovis 株に関する発表された研究では、このデータセットで得られた値よりも高い rho/theta 値 (rho/theta = 0.1) が示されましたが、Patané と同僚の研究では、参照ベースのアセンブリを使用して組換えパラメータを推測しました。アセンブリ手順による手順の詳細は、末端ブランチにおける推定組換えイベントの豊富さと関連付けられています。
次に、r/mパラメータは組換えと突然変異導入の多様性比を表し、その平均値は0.025から0.037の間であり、突然変異と比較して、組換えはM. bovisの遺伝的多様性に与える全体的な影響が低いことを示しています（表3）。 広範な比較のために、同様の方法を使用して、23のゲノムで構成されるMTBCデータセットのr/mパラメータを推定し、平均値0.48620を示しましたが、Patanéと同僚の38のM. bovisデータセットでは、平均値が0.98であることが証明されました。 最初の研究では、23のゲノムのうち2つ（M. bovis BCGと参照株）のみがM. bovisの研究に含まれていたため、得られた値はM. tuberculosisゲノムの過剰発現のために偏っている可能性があります。 2 番目の報告では、解析した Mycobacterium bovis 集団は主に米国および家畜宿主から回収されました。対照的に、私たちのデータセットでは、より多くの地理的場所と宿主種が表現されており、異なる集団の遺伝的特徴を持つ異なるクローン複合体にグループ化されたゲノムも使用されているため、より深く幅広い集団の知識が得られます。私たちのデータセットで得られた差異 r/m 平均値は、同じ分類学上の種に割り当てられた系統間で組換えの程度が大きく異なるという概念と一致しているため、これらの結果は、M. bovis クローン複合体が組換えの差異を示す可能性があることを示しています。この影響は、Didelot と Maiden72 によって示唆されたとおりです。ただし、より多くの M. bovis ゲノムを含めることでこのデータセットを大幅に拡張すると、この点をさらに明確にすることができます。r/m と rho/theta の両方のパラメーターがブランチ間で変動を示し、この結果は他の細菌種に関する報告と一致しています72,73。
最後に、Gubbins パイプラインによって特定された再編成イベントを確認するために、RDP4 ソフトウェアで 6 つの異なるアルゴリズムを使用して、異なるコアマルチ比較を個別にテストしました。全体的に見ると、Gubbins によって特定されたイベントの半分以下が RDP4 によって確認されました (表 4 および 5)。データセット全体を考慮すると、3 つの組み換えイベントが確認されました。2 つは内部ノードに関係し、もう 1 つは末端ブランチの単一のゲノムに関係しており、クローン複合体を割り当てることができませんでした (表 4 および 5)。末端ブランチでのイベントの特定は、現代の M. bovis 株で組み換えがまだ進行中であるか、結果が誤っていることを示している可能性があります70。この仮想的な組み換え領域では、位置の約 20% に未定義のヌクレオチド (N) があり、組み換えシグナルに影響を与えています (補足図 2)。さらに、この領域は、高度に保存されていると予想される16SリボソームRNAをコードするrrs遺伝子に影響を与えるため、この推定組換えシグナルは、配列エラーまたはミスアライメントの結果である可能性があります。その後、Mb0003とMycobacterium bovis AF2122/97の全ゲノムアライメントを実施し、未定義のヌクレオチドとSNPの存在を確認しました。したがって、誤ったアライメントに関連する可能性のある問題は、本研究で実装された生物学的情報によるものではなく、プログラムを学習した後に現れたと考えられます。
内部ノードの組み換え領域にはギャップや未定義のヌクレオチドは見つかりませんでした（図4および5）。これらのイベントのうち、1つはEu2ゲノムのみに含まれ、ポリケチド合成酵素をコードする可能性のあるpks12遺伝子に影響を与えます。一方、もう1つはEu1ゲノムに登録されており、硝酸還元酵素をコードする可能性のあるnarX遺伝子に影響を与えます（表4）。一般的に、組み換え解析では、統計的に裏付けられた組み換え断片の数は限られており、推定された指標は、組み換えがM. bovis系統に与える影響が低いことを示しています。組み換えシグナルは低いと予想されますが、真の進化シグナルをバックグラウンドノイズから区別することが重要であり、これは困難な作業です。参照ベースのアセンブリおよびミスマッチ問題70, 71によって導入されるノイズ信号を低減するため、完全ゲノムを除く残りのすべてを最初からアセンブリし、QUASTパイプライン解析によってアセンブリの品質を確認・保証しました（補足表1）。さらに、調査全体の堅牢性と精度を確保するために、一連の補足解析を実施しました。したがって、narX遺伝子およびpks12遺伝子のシーケンス品質は、Mycobacterium bovis AF2122/97に対するリードマッピングによって評価されました。組換え領域における推奨SNP位置は、方法のセクションで述べた基準（少なくとも20回の読み取りと0.9の変化頻度）を適用して確認されました。 narX遺伝子の多型性は、2つのゲノム（Mb1792361とMb7240415、2.3%）とpks12ゲノムのゲノム（Mb0891、Mb1711、Mb1789、Mb1870、Mb17046、Mb1756、Mb12遺伝子）で完全に確認されました。しかし、ゲノムMb2043については、8つの位置のうち6つがリード深度の基準を満たしていません。これは、SNPが最大17リードでしかサポートされておらず、これは設定されたカットオフ値20を下回っているためです。したがって、このゲノム部位で6つのゲノム（8.6%）の組み換えが確認できます（図4および5）。
Mycobacterium bovisデータセットの組み換え領域アライメントの詳細な可視化は、おそらく硝酸還元酵素をコードするnarX遺伝子に影響を与えます。内部ノードの組み換え領域にはギャップや未定義のヌクレオチドは見つかりませんでした。この特定のイベントはEu1ゲノムに登録されています。narX遺伝子のシーケンス品質は、Mycobacterium bovis AF2122/97のリードをプロットすることで評価しました。方法セクションに記載されている基準（少なくとも20回の読み取りと0.9の変化頻度）を適用して、組み換え領域における推奨SNPの位置を確認してください。Mb1792361およびMb7240415のゲノムでは、narX遺伝子の多型が完全に確認されました（2.3%）。
pks12遺伝子に影響を及ぼすMycoplasma bovisデータセットの組み換え領域アライメントの詳細な可視化。内部ノードの組み換え領域にはギャップや未定義のヌクレオチドは見られませんでした。ポリケチド合成酵素をコードする可能性のあるpks12遺伝子に影響を及ぼすイベントは、Eu2ゲノムのみを含みます。pks12のシーケンス品質は、Mycobacterium bovis AF2122/97のリードマッピングによって評価されました。方法セクションに記載されている基準（少なくとも20回の読み取りと0.9の変化頻度）を適用して、組み換え領域における推奨SNPの位置を確認してください。ゲノムMb0891、Mb1711、Mb1789、Mb1870、Mb1758、Mb2043、およびMb1960の多型は完全に確認されています。
PE および PPE 遺伝子には、イルミナのシーケンスとミスマッピングによって簡単に誤読される反復領域があるため、マッピングからシーケンス戦略を使用する場合にのみ、M. tuberculosis メンバーのバイオインフォマティクスワークフローから削除されます。この研究で適用された組み換えイベントの推論は、PE/PPE を除外しない de novo アセンブリに基づいています。SplitsTree、Gubbins パイプライン、および RDP4 ソフトウェアを介して 3 つの異なる補完的な方法とアルゴリズムを実装することにより、適用された戦略は、エラー信号によって引き起こされる再編成領域の処理とフィルタリングに対して堅牢であると考えています。ただし、SNP クラスターを識別する Gubbins および RDP4 ソフトウェアに対する PE/PPE 遺伝子の干渉を排除し、narX および pks12 遺伝子に影響を与えると提案された組み換え領域を特定するために、これらの遺伝子の近傍が調べられました (補足図 3–5)。 M. bovis AF2122/97では、narX遺伝子はnarK2とMb1764cによって分離されており、pks12はMb2075cとMb2073cに囲まれています（補足図3-5）。MAUVEシンラインマップを用いて作成された完全ゲノムのマップは、遺伝子配列の保存性と再編成に関する情報を提供し、4つの共線的ブロックを示し、ゲノム転座や逆位の兆候は見られませんでした。さらに、アミノ酸配列との相補性解析により、すべての完全ゲノムにおいて相同性が証明され、narXまたはpks12の隣接領域にPE/PPEは見られませんでした。narXについては、1つのゲノム（Mb0030）のシノニムスコアが低くなっています。これは、narX遺伝子が2つの断片（断片1891と1890）として同定されたためです。 pks12については、類似性のため、Mb0030とMb003は低いシンリニアリティスコアを示しましたが、pks12はそれぞれ2つと3つの断片として同定され、タンパク質の異なるドメインを表していました（補足図3-5）。この情報を考慮し、GubbinsとRDP4ソフトウェアの両方で解析を行い、ウィンドウ内の最大500bpのコアマルチプルアライメントを確認した結果、PE/PPE遺伝子がnarXとpks12に影響を与える組換えシグナルに干渉しないことを確認しました。
このデータセットで検出された組み換えシグナルは残余であると考えられるものの、M. bovis における組み換えを排除することはできないのは事実であるため、異なる疫学的シナリオからの全ゲノムを配列決定し、さらに分析を続ける必要があります。
組み換え修正前と修正後の ML 系統樹を比較しても (図 2A、B)、推定された系統関係に大きな変化は見られず、M. bovis 株は同じグループにまとめられました。
新たに配列決定されたM. bovisの42のリードをM. bovis AF2122/97の参照ゲノムにマッピングした結果、1,816の多型位置を含むSNPアライメントが得られました。SNPの大部分（87.1%）はコーディング領域に位置しており、影響を受けた遺伝子はBovilistに示されている機能カテゴリーに従って特徴付けられています（図6A、B）。各機能カテゴリーの遺伝子総数を考慮すると、「脂質代謝」カテゴリーの遺伝子に多くのSNPが見られ、次いで「細胞壁と細胞プロセス」と「中間代謝と呼吸」の順であり、これらの遺伝子がM. bovisの進化段階にあることが明らかになりました。
ポルトガルのM. bovisデータセット（n = 42）の階層的解析。機能カテゴリーごとに登録されたSNPと影響を受けた遺伝子の総数（A）。機能カテゴリーごとに登録された同義および非同義変化の総数（B）。
地球規模で見ると、平均dN/dS比は1.5を超えており、これは地球規模の進化圧が祖先状態を排除することにあることを示しており、肯定的（多様化または指向性）かつ/または緩和された浄化選択シナリオを表しています。「毒性、解毒、適応」、「挿入配列とファージ」、「調節タンパク質」のカテゴリーでは、SNPの3分の2以上が非同義です（図6B）。
すべてのカテゴリーにおいて、複数の SNP を持つ遺伝子があり、その結果、平均変異率 (つまり、遺伝子あたりの平均 SNP) は 1 を超えています (図 6A)。 15 個の SNP を持つ Pks12 (Mb2074c) と 8 個の SNP を持つ fas (Mb2553c) は、変異値が高くなっています。 これらの遺伝子は両方とも脂肪酸代謝に関与しています。 pks 遺伝子は、結核菌の細胞壁脂質生合成に関与する多機能酵素であるポリケチド合成酵素 (PKS) をコードしています74,75。 この遺伝子は、マイコケチドの合成に関与する多機能ポリペプチドをコードしています74,76。 fas 遺伝子は、ミコール酸の合成に関与しています。 これらの遺伝子は両方とも、宿主と接触する細胞壁の生合成に重要な役割を果たしています。
Mycobacterium bovisの進化をさらに研究するため、2組の特定の遺伝子を解析した。配列構成法と系統学的手法を用いたこれまでの研究では、MTBCの祖先が多様化前にHGTによって獲得した遺伝子が同定されている37,38。これらの遺伝子は補足表2に列挙されている。HGTに関連する可能性のある合計77個の遺伝子のSNP分布を解析した結果、26個の多型部位が同定され、その大部分（78%）は非同義（NS）変化をもたらした（補足表2）。MTBCゲノムに関するこれまでの研究では、推定HGT領域はゲノムの他の部分と比較してNS SNP比が高いことが示されていた。これらの組み換え領域がMTBCの祖先によって獲得され、したがって古代の多型を過剰に代表すると考えると、NS置換はアミノ酸変化によって負の選択によって排除されると予想されるため、同義変化の割合はより高くなると予想されます。タンパク質の機能を変化させる可能性があるためです。したがって、我々の研究結果は、機能的影響がHGT様遺伝子の置換に起因する可能性があることを示唆しており、これはHGT様遺伝子が貴重な適応的遺伝的多様性にとって重要であることを反映しています。
この分析と並行して、3R（DNA修復、複製、および組換え）システムの構成要素をコードする遺伝子が、dos Vultosと共同研究者（2008）39によって以前に公開されたリストに従って徹底的に調べられました。同一のDNA断片の交換は直接観察することはできませんが、このデータセットの場合のように、近縁の細菌が関与している場合は頻繁に起こるプロセスである可能性があります。さらに、このプロセスはDNA修復方法72の鍵となる可能性があるため、相同組換えで役割を果たします。54個の遺伝子に分布する合計26個の多型位置が特定されました（補足表3）。この遺伝子セットでは、NS変化が結果の約65％を占めており、これはMycobacterium tuberculosis株に関する以前の報告と一致しています。
投稿日時: 2021年10月21日